Journal of Biotechnology and Biodiversity | v.8 | n.2 | 2020
Journal of Biotechnology and Biodiversity
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Avaliações antioxidante e antifúngica dos óleos essenciais de Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne e Hymenaea courbaril L.
Antonio Carlos Pereira de Menezes Filhoa* , Josemar Gonçalves de Oliveira Filho b ,
Carlos Frederico de Souza Castro a
a Instituto Federal Goiano, Brasil
b Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho, Brasil
* Autor correspondente (astronomoamadorgoias@gmail.com )
I N F O A B S T R A C T
Keyworks
biological activity volatile oil
fruit shell DPPH Sclerotinia Aspergillus Colletotrichum
Antifungal and antioxidant evaluations of the essential oils from Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne and Hymenaea courbaril L.
Hymenaea stigonocarpa and Hymenaea courbaril var. courbaril are plant species belonging to the Leguminosae
family, found in the Cerrado domain. They present annual fruiting with fruits with dense and aromatic peel. The objective of this work was to evaluate the yield, antioxidant and antifungal activities of pure oil and mix (mixture of
both oils in equal concentration). For extraction, Clevenger type equipment was used, the yield was determined in
percentage. The antioxidant activity was determined in microplates using the DPPH radical as a model in the following concentrations, starting from pure oil, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2.5 and 1.25 µL mL-1. The antifungal activity
was evaluated by agar diffusion using successive dilutions of pure essential oil and in concentrations of 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 and 1.56 µL mL-1 and mix mixture of both oils in equal parts in DMSO, on Sclerotinia sclerotiorum ,
Colletotrichum acutatum and gloeosporioides, and for Aspergillus flavus and niger. The yield was 0.04 and 0.06%
for H. stigonocarpa and H. courbaril, respectively. The antioxidant activity showed good results, for both essential oils of H. stigonocarpa and H. courbaril with high reduction of DPPH radical to pure and in concentrations 50 and
40 µL mL-1. For the mix, the concentration is 50 µL mL-1, a rate of 72% reduction. In the antifungal experiment, high
efficiency was observed in the growth control of hyphae for the essential oil of H. stigonocarpa with 83% on Sclerotinia sclerotiorum, 75% on C. acutatum, and for A. flavus with 55%, respectively. For H. courbaril essential
oil, an inhibition rate of 100% was observed for S. sclerotiorum, 100% for C. gloeosporioides and 70% for A. flavus .
The essential oils mix showed a reduction in growth of 88% for S. sclerotiorum, 56% for C. gloesporioides and 42% for A. niger. Pure and mix essential oils showed promising results as natural antioxidant and antifungal agents in
vitro .
R E S U M O
Palavras-chave s
atividade biológica óleo volátil
casca fruto DPPH Sclerotinia Aspergillus Colletotrichum
Hymenaea stigonocarpa e Hymenaea courbaril var. courbaril são espécies vegetais pertencentes a família Leguminosae, sendo encontrados no domínio Cerrado. Apresentam frutificação anual com frutos com casca densa e aromática. O trabalho teve por objetivo avaliar o rendimento, e as atividades antioxidante e antifúngica do óleo puro
e mix (mistura de ambos os óleos em igual concentração). Para extração, foi utilizado equipamento tipo Clevenger, o rendimento foi determinado em porcentagem. A atividade antioxidante foi determinada em microplacas utilizando como modelo o radical DPPH nas seguintes concentrações, partindo do óleo puro, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2,5 e 1,25 µL
mL-1. A atividade antifúngica foi avaliada por difusão em ágar utilizando sucessivas diluições de óleo essencial puro e nas concentrações 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 e 1,56 µL mL-1 e mix mistura de ambos os óleos em partes iguais em
DMSO, sobre Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum acutatum e gloeosporioides, e para Aspergillus flavus e niger . O rendimento foi de 0,04 e 0,06% para H. stigonocarpa e H. courbaril, respectivamente. A atividade antioxidante
apresentou bons resultados, para ambos os óleos essenciais de H. stigonocarpa e H. courbaril com alta redução do
radical DPPH para puro e nas concentrações 50 e 40 µL mL-1. Já para o mix a concentração 50 µL mL-1 taxa de 72% de redução. No experimento antifúngico foi observada alta eficiência no controle de crescimento das hifas para o óleo
essencial de H. stigonocarpa com 83% sobre Sclerotinia sclerotiorum, 75% sobre C. acutatum, e para A. flavus com
55%, respectivamente. Para o óleo essencial de H. courbaril foi observada taxa de inibição de 100% para S. sclerotiorum, 100% para C. gloeosporioides e de 70% para A. flavus. Já para o mix de óleos essenciais foi observada
redução no crecimento de 88% para S. sclerotiorum, 56% C. gloesporioides e de 42% para A. niger. Os óleos
essenciais puros e mix apresentaram resultados promissores como agentes antioxidantes e antifúngicos naturais in vitro .
Received 03 January 2020; Received in revised from 25 May 2020; Accepted 20 June 2020
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INTRODUÇÃO
animais herbívoros, insetos e em fitopatologias as quais podem levar o vegetal à morte. São
A família Leguminosae inclui extraídos através das técnicas por arraste a vapor
aproximadamente 727 gêneros e mais de 19.327 espécies, estando presente em todos os continentes, exceto na Antártida. No Brasil são registrados 221 gêneros e mais de 2.809 espécies, sendo 156 gêneros e 925 espécies (Souza et al. , 2016). Conforme Souza et al. (2016), De Candolle (1825), posicionou Hymenaea na tribo Cassieae (Caesalpinioideae), entretanto, estudos posteriores consideram o gênero inserido em Detarieae (Mackinder, 2005). Estudos genéticos e de sistemática sustentam o monofiletismo da tribo Detarieae, sendo o clado Hymenaea apresentando
ou por prensagem a frio, esta última, menor difundida entre os químicos orgânicos que trabalham com produtos naturais, há outras técnicas, estas mais atuais utilizando fluído supercrítico, enfleurage, por solventes que estão sendo empregadas na extração de OEs (Bizzo et al., 2009). Os OEs são compostos principalmete por monoterpenos, diterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanoides, esta constituição confere as características organolépticas e biológicas, ações com atividade atinfúngica e antibacteriana, dentre outras, como antioxidante, antiinflamatória,
estreita afinidade entre os gêneros Hymenaea, antitumoral, anti- hiperlipidêmico,
Guibourtia Benn. e Peltogyne Vogel.
O gênero Hymenaea, tem entre diversas espécies, os indivíduos Hymenaea stigonocarpa Mart. ex Hayne conhecido por “jatobá-do - cerrado” e o Hymenaea courbaril L. conhecido popularmente por “jatobá-do-campo”. Lee e Langenheim (1975) propuseram em revisão do gênero o reconhecimento de duas seções: 1ª Hymenaea apresentando características nas inflorescências curto-paniculadas, com 8-15 cm compr., corimbosas quando maduras, e flores de tamanho médio; e 2ª Trachylobium (Hayne) Baill., por inflorescências longo-paniculadas, com 18- 35 cm compr., com flores pequenas. Nos estudos de Pestana (2010), o pesquisador prôpos sinonimizações da espécie dúbia H. capanema a H. courbaril var. courbaril, e das variedades de H. stigonocarpa .
Hymenaea é um gênero neotropical, com distribuição disjunta na costa leste da África onde ocorre apenas uma espécie (Mackinder, 2005). Um total de 17 espécies, sendo 15 são citadas somente no Brasil, sendo utilizadas para extração de madeira, resina, casca, folhas e frutos (Lima; Pinto, 2015; Souza, 2013; Aquino et al., 2007). Ambas as espécies são encontradas no domínio Cerrado, apresentando anualmente grandes safras de frutos que servem de alimento para roedores, veados e também para o homem do campo. Os frutos apresentam casca dura e densa, contendo nesta, resina e óleo essencial (OE) com aroma forte e característico (Menezes Filho et al., 2018; Carvalho Filho et al., 2003; Botelho et al., 2000; Silva et al., 1998).
Os óleos essenciais (OEs) são produtos do metabolismo secundário dos vegetais, sendo produzido naturalmente, estando envolvidos no processo de polinização, na defesa, agindo contra
imunomodulador, antinociceptivos, citotóxicos e antivirais (Fallah et al., 2020; Lima et al., 2006; Jahaniani et al., 2005; Glshani et al., 2004; Amirhofran et al., 2000; Sajjadi et al., 1998), sendo também populares entre as indústrias farmacêuticas, de alimentos, de perfumaria e de cosméticos (Himed et al., 2019).
Agentes antioxidantes naturais são compostos de classes químicas produzidas naturalmente pelas plantas através do metabolismo secundário do vegetal. Os OEs apresentam ser eficiêntes na função de proteção contra inúmeros radicais livres que constantemente são absorvidos pelo nosso organismo. A oxidação é o processo metabólico que possui a função de produzir energia para atividades enssenciais na manutenção do corpo. O metabolismo do O2 nas células humanas e d e
animais, levam a produção de radiais livres que são responsáveis por provocar danos ao organismo em nível celular, na molécula de ácido desoxirribonucléico (DNA), no tecido lipídico, em proteínas, dentre outras (Roesler et al., 2007). De acordo com Shami e Moreira (2004), dentre os radicais livres estão incluídos o superóxido (O2•- ), a hidroxila (OH•), o hidroperóxido (HO2•), o óxido nítrico (NO•) e o dióxido de nitrogênio (NO2•). A
efetiva atividade antifúngica também é observada em inúmeros OEs contra agentes fúngicos causa- dores de doenças em humanos, animais e em ve- getais agricultáveis.
O Sclerotinia sclerotiorum conhecido por “mofo-branco ou podridão branca da haste da soja” ataca anualmente plantações de soja e feijão causando perdas de produtividade. Este fungo produz escleródios que podem ficar viáveis no solo por até 11 anos, sendo difícil sua erradicação, pois os fungicidas sintéticos não demonst ram serem eficientes na eliminação desta forma
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reprodutiva (Silva et al., 2018; Garcia et al., 2012). Este é um fungo terrícola, necrotrófico, cosmopolita e inespecífico que ataca diversas espécies vegetais em monocotiledôneas e dicotiledôneas de amplo espectro agronômico (Boland e Hall, 1994), sendo patogênico para 78 famílias, 278 gêneros e 408 espécies de plantas com importância econômica (Putrick et al., 2018). O Colletotrichum é outro gênero fúngico que apresenta inúmeras espécies de grande importância fitopatológica na agricultura, causando diversas doenças conhecidas por antracnose. As espécies, C. gloeosporioides e C.
descontrolado aliado a falta de rotação de culturas, trazem sérias desvantagens para o meio ambiente, aos aplicadores e aos consumidores, além disso, ocasiona o desenvolvimento de formas resistentes de fitopatógenos (Celoto et al., 2008). A busca por alternativas mais conscientes visando a produção agrícola e a preservação do meio ambiente, a saúde humana e o bem estar animal, inúmeros trabalhos vem sendo desenvolvidos utilizando extratos vegetais, óleos fixos e OEs. E entre eles, vários apresentam importantes resultados equiparáveis aos agentes fungicidas comerciais (Hüller et al., 2019; Tico et al., 2019).
acutatum causam consideráveis perdas O trabalho teve por objetivo avaliar as
econômicas em diversas fruticulturas ainda na fase de desenvolvimento e de pós-colheita (Ramos et al., 2016). A antracnose está presente em regiões tropicais e subtropicais, com clima propício para a fácil proliferação entre as frutas, em um curto intervalo de contaminação. Os fungos do gênero Colletotrichum se desenvolvem bem em culturas de mamão, manga, abacate, morango, pera, banana, caju, maracujá e em goiabas (Da Silva et al., 2009; Filho et al., 2003).
Menção também deve ser feita para outro gênero de fungos fitopatológicos e patológicos (Deus et al., 2011). O gênero Aspergillus , apresenta dezenas de espécies, em especial, o A. flavus e A. niger. Os representantes do gênero Aspergillus são considerados fungos persistentes durante o armazenamento, deteriorando principalmente grãos e sementes, produzindo a partir do seu metabolismo secundário micoto xinas e aflatoxinas (Terra, 2005; Athié et al., 1998). Esse gênero fúngico pode causar distúrbios alimentares, podendo estar ligados a diversos tipos de cânceres, bem como, no aumento das células CD4 em portadores do vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), e também por causarem a “aspergilose” como é conhecido o grupo de doenças causadas por espécies termotolerantes de Aspergillus (Lopes et al., 2004). De acordo com Lima et al. (2014), os Aspergillus representam cerca de 10% das infecções fúngicas em se res humanos e em animais. Os principais grãos contaminados por esse gênero são amendoim, grão-de-bico, soja, milho e sorgo, bem como podem estar presentes no óleo fixo onde diminuem os valores nutricionais do produto, podendo também ocasionar óbito entre humanos e animais (De Souza et al., 2010; Dhingra e Coelho Neto, 1998; Engle et al., 1982).
O uso de fungicidas sintéticos apresentam efetiva atividade antifúngica, entretanto, o uso
características antioxidante e antifúngica dos óleos essenciais das cascas dos frutos de Hymenaea stigonocarpa e Hymenaea courbaril var. courbaril puro e em mix (mistura de óleos essenciais na concentração (1:1)) sobre S.sclerotiorum , Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum acutatum, Aspergillus flavus e Aspergillus niger .
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e identificação
Os frutos de Hymenaea stigonocarpa e Hymenaea courbaril var. courbaril foram coletados no período entre março a outubro de 2019, em duas áreas de preservação permanentes (APPs), localizadas no município de Rio Verde, Goiás, Brasil. As áreas de coletas foram georreferenciadas para H. stigonocarpa 17°47’20.5’’S 50°57’53.9’’W e H. courbaril 17°34’45.1’’S 50°56’45.5’’W.
As espécies foram identificadas pelo Biólogo Msc. Antonio Carlos Pereira de Menezes Filho, sendo duas exsicatas herborizadas, identificadas e depositadas no Herbário do IF Goiano, com os seguintes vouchers HRV: 1.461 e 1.462.
Os frutos foram coletados manualmente na serrapilheira, e levados para o laboratório de Química Tecnológica onde foram previamente lavados com água corrente e secos a temperatura ambiente para a retirada da casca, arilo com sementes com auxílio de um martelo.
Após retirada da casca, essa foi novamente triturada com auxílio do martelo em seixos de 1 cm (tamanho máximo). Em seguida, o material foi triturado em moinho de facas tipo ciclone Willye (Fortinox, Mod. Star FT-60 Macro). O moi nho apresenta peneira granulométrica de 32 mesh interna. O pó obtido da casca, foi armazenado em embalagem para alimentos e mantida em refrigeração a -8 °C em freezer até a etapa de
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obtenção do OE.
Extração e rendimento de óleo essencial
Para a extração do OE, foi utilizado sistema tipo Clevenger (Marconi, Mod. MA553/2000), em refluxo por 4 horas. Para isso, três alíquotas de 100 g de pó foram pesadas em balança analítica digital (Marte, Mod. W220) e transferidas para balões de 2 L (Laborglas), acrescidos com 500 mL de água destilada. Após esse tempo, o hidrolato foi recolhido e transferido para funil de separação de 500 mL (Laborglas), onde foi lavado três vezes com 10 mL de diclorometano (Alphatec, P.A – ACS, pureza 99,9%). A fase orgânica foi recolhida e seca com sulfato de sódio anidro (Fmaia, P.A – ACS, pureza 100%), e em seguida, filtrado em papel de filtro qualitativo (Unifil, C42). O sobrenadante foi armazenado em frasco tipo béquer de 150 mL (Laborglas) envolto em papel alumínio com pequenos furos para a volatilização do solvente. O sistema foi mantido em ambiente climatizado com temperatura a 20 °C até completa evaporação do solvente. Logo após, o OE foi pesado em balança analítica digital, e sua massa expressa em porcentagem de rendimento de extração (%).
Atividade bioativa
A atividade bioativa foi determinada conforme descrito por Mezza et al. (2018) com modificações. Utilizou-se o radical livre 2,2 - difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Sigma- Aldrich, P.A – ACS, pureza 100%). O ensaio antioxidante foi realizado pelo método de microdiluição em microplacas de 96 poços (Videplast), utilizando leitora de microplacas UV-Vis (Hexis Científica, Mod. Sectramax 190). Para cada poço foram
adicionados 100 µL mL-1 de solução metanólica
de DPPH na concentração 0,06 mMol mL-1, e 100 µL mL-1 de OE diluído em metanol (Diâmica, P.A
– ACS, pureza, 99,8%) nas seguintes diluições
com concentrações de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2,5 e 1,25 µL mL-1 .
Neste experimento, foi avaliado a percentagem de redução do radical livre em dif erentes concentrações de OE individualmente e por mix (1:1) entre os OEs de Hymenaea, como citado anteriormente. A microplaca com as amostras foi mantida em ambiente a 20 °C na ausência de luz.
A leitura foi realizada no comprimento de ondas em 517 nm, após 1 h. para óleo essencial puro (OE puro), e de 35 min. óleo essencial mix (Mix OEs) após o início da reação. Uma curva padrão foi realizada com a solução de DPPH na concentração 0,06 mMol. Como controle negativo utilizou-se a solução mãe de DPPH 0,06 mMol, e como branco o metanol. Os resultados foram expressos em percentagem de redução de DPPH (%).
Atividade antifúngica em difusão em ágar
Para determinação da atividade antifúngica sobre os isolados de Sclerotinia slcerotiorum , Colletotrichum acutatum e Aspergillus flavus, foi realizado em diferentes concentrações OE puro, e para Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloeosporioides e Aspergillus niger, foi utilizado mix dos OEs em ambas as espécies vegetais de Hymenaea. A metodologia em difusão em ágar foi empregada neste estudo.
Os isolados de S. sclerotiorum, C. gloeosporioides, C. acutatum, A. niger e A. flavus , foram coletados em campos de cultura de soja no município de Jataí, em fruticulturas de mamoeiro e maracujazeiros nos municípios de Itumbiara e Morrinhos, e em bagaços da cultura de cana-de - açúcar em Rio Verde, Goiás, Brasil. As culturas foram mantidas em meio batata, dextrose e ágar (Kasvi, BDA). Os isolados foram doados pelos laboratórios de Química Tecnológica e de Produtos Naturais do IF Goiano, Campus Rio Verde, Goiás, Brasil, e mantidos em banco micológico no laboratório de Química Tecnológica na mesma instituição. A atividade antifúngica dos OEs sobre o crescimento micelial dos isolados fúngicos, foi avaliado através de diferentes concentrações, partindo do OE puro 100, e sucessivas diluições 50; 25; 12,5; 6,25; 3,13
e 1,56 µL mL-1 em dimetilsulfóxido (DMSO) (Vetec, P.A – ACS, pureza 99,7%). Como controle negativo, utilizou-se a testemunha (ausência de óleo essencial) e DMSO puro, e como controle positivo fungicida comercial
Frowncide® 500 SC (ISK, Fluazinam), registro no
Ministério da Aricultura nº 7695, na concentração de 10 µL mL-1 .
As concentrações dos OEs foram adicionadas ao meio de cultura BDA após esterilização e resfriamento, bem como para os tratamentos com o fungicida comercial e DMSO. Após solidificação do meio, em câmara de fluxo laminar bacteriológica (Marconi, Mod. 100 MA1550), 1
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disco de micélio para cada isolado individualmente de S. sclerotiorum, C. gloeosporioides, C. acutatum, A. flavus e A. niger com 7 mm de diâmetro, foi depositado no centro da placa de Petri com 10 cm de diâmetro. E m seguida foram incubadas em estufa bacteriológica (Nova Instruments, Mod. NI 1521) em diferentes temperaturas para cada espécie fúngica nas temperaturas 20 °C (Hamid et al., 2018), 22 °C (Bagherabadi et al., 2018), 22 °C (Bragança et al., 2016), 25 °C (Deshmukh et al., 2020), e 25 °C (Magalhães et al., 2019), respectivamente.
A avaliação consistiu em medições diárias do diâmetro das colônias, por meio de um paquímetro digital 150 mm (Digimes, Mod. 100-170) exatidão 0,03 mm, resolução de 0,01 mm/.0005’’/1/1 28’’,
iniciadas 24 horas após o início da incubação e encerradas, quando as colônias fúngicas do tratamento testemunha, atingiram completamente a área interna da placa. A determinação do percentual de inibição de crescimento PIC foi realizado conforme proposto por Garcia et al. (2012). A seguir, está apresentada a equação 1, utilizada na determinação da PIC.
%PIC = (DTT – DTQ)/DTT x 100 E. [1]
Onde %PIC = percentual de inibição de crescimento, DTT = diâmetro no tratamento testemunha, DTQ = diâmetro no trat amento químico.
Análise estatística
A análise estatística consistiu em triplicatas para o rendimento de OE e para atividade antioxidante, e em quadruplicata para a análise antifúngica. Os resultados foram expressos através da média artimética da triplicata, seguida de (±) desvio padrão. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA). Foi utilizado teste de Tukey (p < 0,05) para determinação da diferença estatística entre os tratamentos do rendimento e da atividade bioativa, e para atividade antifúngica, adotou-se o teste de Scott - Knott, com nível de significância de 5%. O software estatístico utilziado foi o PAST 3 (versão livre, 2019).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O rendimento de OE foi de 0,04 ± 0,13a para H. stigonocarpa, e de 0,06 ± 0,09a para H. courbaril var. courbaril. Ambos os redimentos não apresentaram diferença estatística pelo teste de Tukey (p < 0,05).
Na tabela 1, estão apresentados os resultados da atividade antioxidante dos OEs para as cascas dos frutos de H. stigonocarpa, H. courbaril var. courbaril e para o Mix (1:1) entre os OEs.
Tabela 1 - Ativiade antioxidante dos óleos essenciais das cascas dos frutos de H. stigonocarpa, H. courbaril var. courbaril e Mix (H. stigonocarpa e H. courbaril), concentração (1:1) na redução do radical livre DPPH.
Concentração µL mL-1 OEHs* OEHc** Mix***
Puro 100 ± 0,00aA 100 ± 0,00aA -
50 90,55 ± 0,42aA 100 ± 0,00aA 72,17 ± 0,18aB
40 86,00 ± 0,13aB 98,63 ± 0,16aA 60,71 ± 0,45bC
30 71,11 ± 0,11bB 90,69 ± 0,33bA 54,33 ± 0,33cC
20 68,64 ± 0,23bcB 83,35 ± 0,16cA 20,70 ± 0,80dC
10 53,05 ± 0,69dB 71,22 ± 0,64dA 10,81 ± 0,59eC
5 26,37 ± 0,41eB 58,80 ± 0,42eA -
2,5 18,94 ± 0,63eB 33,19 ± 0,78fA -
1,25 - 18,66 ± 0,31g -
*OEHs = Óleo essencial Hymenaea stigonocarpa. **OEHc = Óleo essencial Hymenaea courbaril var. courbaril. ***Mix = (1:1) dos óleos essenciais de Hymenaea stigonocarpa e H. courbaril. (-) = Não determinado. Letras pequenas iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). Letras grandes diferentes na mesma linha diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
A atividade antioxidante na redução do DPPH para o OE H. stigonocarpa, apresentou alta eficiência, em todas as concentrações, exceto, em
1,25 µL mL-1 onde não houve inibição. A taxa de inibição foi determinada em percentagem de sequestro de DPPH, visto que, não foi utilizado
modelo para determinação de EC50. Nas concentrações 40, 50 e óleo puro foram
observados as maiores taxas de redução de DPPH, entretanto, não diferiram entre si pelo teste de Tukey, respectivamente. Para o OE H. courbaril var. courbaril, apresentou atividade antioxidante
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em todas as concentrações, em especial para as concentrações 10; 20; 30; 40; 50 e OE puro com percentagens variando entre 71 a 100%.
O mix de OEs H. stigonocarpa e H. courbaril var. courbaril, apresentou também eficiência como agente antioxidante, nas concentrações avaliadas. Nas concentrações onde houve atividade antioxidante, em especial para as
concentrações 30; 40 e 50 µL mL-1 foram obtidos resultados entre 54 a 72% de redução do DPPH. Entre os OEs de H. stigonocarpa e H. courbaril var. courbaril na concentração de OE puro, não houve diferença entre ambos pelo teste de Tukey .
Na concentração de 50 µL mL-1, apresentou diferença significativa no mix, onde o mesmo não foi observado entre os OEs, entretanto inferior ao OEs puros. Na concentração 40 µL mL-1, houve diferença estatística entre as três amostras. Nas concentrações 40; 30; 20; 10; 5; 2,5 µL mL-1 , apresentaram diferença significativa entre as três amostras avaliadas.
Os resultados de atividade antioxidante, demonstraram que os OEs de Hymenaea stigonocarpa e Hymenaea courbaril var. courbaril, bem como, o mix apresentaram alta eficiência de inibição, sendo esta eficiência, uma nova possibilidade para novos testes em produtos farmacêuticos, na cosmetologia e na produção de alimentos. Como inexistem resultados que avaliam a atividade antioxidante do OEs das casas dos frutos de Hymenaea, a atividade antioxidante foi comparada com outros OEs de diversos grupo s vegetais.
Menezes Filho et al. (2020) avaliaram os OEs
das folhas e raízes de C. regium onde descrevem importante atividade antioxidante mesmo em baixas concentrações de OE diluído em DMSO. Os pesquisadores encontraram entre as concentrações 30, 50 e 50 µL mL-1 atividade igual a 100% de redução do modelo radicalar DPPH. Da Silva et al. (2019) avaliaram a atividade antioxidante do OE de S. lentiscifolius onde encontraram atividade de redução de 54,4% na concentração de 100 mg mL-1 na redução do DPPH.
Na figura 1, estão apresentados resultados da porcentagem de inibição sobre o crescimento PIC para o OE da casca do fruto de H. stigonocarpa sobre os isolados de S. sclerotiorum, C. acutatum e A. flavus .
Na figura 1, observam-se alta eficiência de ini- bição para os isolados de S. sclerotiorum, C. acu- tatum e A. flavus em diferentes concentrações do OE da casca do fruto de H. stigonocarpa. Para S. sclerotiorum em especial nas maiores concentra- ções, apresentaram alta porcentagem de inibição de crescimento nas concentrações 12,5; 25; 50 e 100 µL mL-1, com taxas entre 56 a 83%. Entretan- to, não houve diferença estatística entre as concen-
trações 50 e 100 µL mL-1. Para C. acutatum, tam- bém foi observado o mesmo padrão de PIC obser- vado no isolado de S. sclerotiorum. Reitera-se que, as maiores concentrações entre 12,5; 25; 50 e 100 µL mL-1, apresentaram as maiores taxas de inibi- ção entre 66 a 75%. Neste experimento não houve diferença significativa entre as concentrações 25,
50 e 100 µL mL-1. Na menor concentração de 1,56 µL mL-1 não houve atividade de inibição.
Figura 1 - Porcentagem de inibição de crescimento PIC do óleo essencial de Hymenaea stigonocarpa, sobre isolados de Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum acutatum e Aspergillus flavus. Letras iguais não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância.
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O isolado de A. flavus, foi o modelo fúngico que apresentou os menores índices de atividade antifúngica, possivelmente esse fungo seja pouco sensível aos compostos do OE de H. stigonocarpa . Observa-se que a efetividade na inibição é obser- vada apenas nas maiores concentrações 25; 50 e 100 µL mL-1 com taxas de PIC entre 39 e 55%. Entretanto, a baixa sensibilidade ao OE ainda apresentou bons resultados. Possivelmente a tem- peratura para o desenvolvimento do fungo influ- enciou também, entretanto negativamente nas concentrações, volatilizando os compostos de menor cadeia carbônica para monoterpenos, diter- penos e triterpenos (Benato et al., 2018; Paulus et al., 2013; Radünz et al., 2006).
Os três ensaios fúngicos foram comparados ao
fungicida comercial Frowncide na concentração de 10 µL mL-1 com 100% de PIC.
Silva et al. (2018) avaliaram o OE de P. guaja- va (goiaba) em duas épocas de extração, onde obtiveram inibição micelial para S. sclerotiorum
de 94,9 e de 93,4% na concentração de 300 µL mL-1, de 90,8 e 90,0% na concentração de 200 µL mL-1 e de 77,5 e 80,0% na menor concentração
usual de 100 µL mL-1. Lima et al. (2014) verifica- ram inibição entre 95 a 100% no crescimento em A. flavus proporcionado pelo OE de cravo-da - índia (S. aromaticum). Já para o OE de melaleuca, os pesquisadores obtiveram PIC em todas as con- centrações avaliadas, com maior eficiência na concentração de 15 µL com 8% de inibição. Nos estudos desenvolvidos por Vivas et al. (2006), os pesquisadores verificaram que o efeito fungicida do OE do capim-santo inibiu completamente o crescimento micelial em C. acutatum em concen- trações superiores a 100 µL mL-1 .
Na figura 2, estão apresentadas as porcentagens de inibição de crescimento pelo OE da casca do fruto de Hymenaea courbaril var. courbaril sobre os isolados de S. sclerotiorum, C. acutatum e A. flavus em diferentes concentrações.
Figura 2 - Porcentagem de inibição de crescimento PIC do óleo essencial de Hymenaea courbaril var. cour- baril, sobre isolados de Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum acutatum e Aspergillus flavus. Letras iguais não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância.
O OE de H. courbaril var. courbaril também apresentou boa eficiência de PIC sobre os iso lados de S. sclerotiorum e C. acutatum. Em todas as concentrações, exceto para 1,56 e 3,13 µL mL-1 . Foi observado que ambos os isolados são sensíveis a complexa constituição do OE da casca do fruto de H. courbaril. Para A. flavus foi observado bons resultados, entretanto, como observado para o OE de H. stigonocarpa, o fungo apresenta também resistência em todas as concentrações para este OE.
As melhores concentrações usuais para inibir o desenvolvimento de S. sclerotiorum, C. acu tatum
e A. flavus são concentrações acima de 12,5 µL mL-1, que apresentaram PIC comparável ao fungi- cida de referência. Entretanto, para A. flavus as concentrações 50 e 100 µL mL-1 apresentaram ser as mais eficazes para inibição fúngica.
Bonaldo et al. (2007), encontraram para o OE de E. citriodora, atividade de inibição micelial entre 90 a 100% para S. rolfsii, Phytophthora sp., A. alternata, C. sublineolum e R. solani em con- centrações entre 40 a 1000 µL. Schwan-Estrada et al. (2000), encontraram em seus estudos in vitro , para o extrato bruto e OE de manjerona boa efici- ência de inibição de crescimento micelial, e de
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esporulação em diversos fungos fitopatogênicos testados.
Na figura 3, estão apresentados os resultados da porcentagem de inibição de crescimento pelo mix de OEs das cascas de ambos os frutos de H. stigo- nocarpa e H. courbaril var. courbaril sobre isola- dos de S. sclerotiorum, C. gloeosporioides e A. niger em diferentes concentrações.
O mix dos OEs demonstrou ser mais eficaz apenas para o isolado de S. sclerotiorum. Para os isolados de C. gloeosporioides foi observado uma discreta PIC, e com menor intencidade de inibição, seguido para A. niger. O S. sclerotiorum
demonstra ser altamente sensível, corroborando com os resultados apresentados nas (Figuras 1 e 2) para OEs puros. Na figura 3, observa-se que o doseamento de ambos os OEs das cascas dos frutos de Hymenaea não apresentou resultados superiores quando comparado aos OE puros. O mesmo é observado quando comparado ao fungicida de referência, com resultados inferiores conforme observado no teste de Scott-Knott a 5%. O intuíto da avaliação pelo mix de OEs foi para observar possível potencialização de ambos os OEs, entretanto, não demonstraram resultados satisfatórios para os isolados investigados.
Figura 3 - Porcentagem de inibição de crescimento PIC do mix dos óleos essenciais de Hymenaea stigono- carpa e Hymenaea courbaril var. courbaril, sobre isolados de Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloeosporioides e Aspergillus niger. Letras iguais não diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância.
Lima et al. (2014), encontraram baixa eficiência no controle de crescimento micelial em A. niger utilizando OE de Melaleuca alternifolia. Os pes- quisadores obtiveram inibição de 1, 3 e 14% para as concentrações 5, 10 e 15 µL. Souza Júnior et al. (2009), avaliaram diferentes concentrações de OEs de alecrim-pimenta, alfavaca-cravo, capim-santo e cidrão onde obtiveram 100% de inibição de cres- cimento em todas as concentrações avaliadas, e entre 44,0 a 69,0% para o OE das folhas de goia- ba. Carnelossi et al. (2009), e Silva et al. (2009), encontraram inibição de 100% para C. gloeospo- rioides utilizando OE de capim-limão ( Cymbopo- gon citratus) em concentrações entre 10 e 100 µL. Celoto et al. (2008), avaliaram diferentes extratos vegetais (aquoso e hidroetanólico) onde encontra- ram também importantes resultados de PIC para C. gloeosporioides. O OE de C. zeylanicum apre- sentou boa eficiência de inibição para A. niger nos estudos de Pawar e Thaker (2006).
CONCLUS ÃO
Os óleos essenciais de Hymenaea stigonocarpa e Hymenaea courbaril var. courbaril apresentaram bons rendimentos de extração, bem como alta eficiência biológica como agentes antioxidante (puro e mix (1:1)) e antifúngico in vitro. Os isolados de Sclerotinia slcerotiorum , Colletotrichum acutatum e Aspergillus flavus demonstraram ser altamente senssíveis aos óleos essenciais quando aplicados individualmente, e o mesmo foi observado apenas para Sclerotinia sclerotiorum no mix (1:1) dos óleos essenciais para ambas as espécies do gênero Hymenaea . Trabalhos futuros deverão ser realizados avaliando as atividades antioxidante e antifúgica em modelos biológicos para determinação da eficácia como possíveis novos agentes antioxidantes em alimentos e formulações farmacêuticas, e também como em nanocápsulas e microcápsulas contendo óleo essencial verificando
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o comportamento dos óleos essenciais em casa-de - vegetação, ou in situ em campos de cultivos.
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto Federal Goiano, Campus Rio Verde; aos laboratórios de Química Tecnológica, Bioensaios e Biomoléculas, Química de Produtos Naturais, Fisiologia Vegetal e Sistemática Vegetal; ao Herbário do IF Goiano, Campus Rio Verde; ao órgãos de fomento em pesquisa, CNPq, CAPES, FINEP, e a FAPEG pela bolsa de mestrado em Agroquímica a Antonio Carlos Pereira de Menezes Filho.
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© 2020 Journal of Biotechnology and Biodiversity ISSN: 2179- 4804
DOI: https://doi.org/10.20873/jbb.uft.cemaf.v8n2.menezes
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