Journal of Biotechnology and Biodiversity | v.7 | n.2 | 2019
Journal of Biotechnology and Biodiversity
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Suplementação de aminoácidos na fermentação alcoólica de mostos de melaço e xarope de cana-de-açúcar empregando linhagem
industrial CAT- 1
Camila de Souza Varizea*, Renata Maria Christofoleti-Furlana, Mariane Soares Raposoa , Carolina Tieppo Camarozanoa, Lucas Dantas Lopesa, Elisangela de Souza Miranda Muynarska , Thalita Peixoto Bassoa, Luiz Carlos Basso a
a Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (USP), Brasil
* Autor correspondente (camilasv@usp.br )
I N F O A B S T R A C T
Keyworks
histidine amino acid
supplementation alcoholic fermentation S. cerevisiae
Amino acid supplementation in alcoholic fermentation of molasses must and sugarcane syrup using CAT - 1 industrial lineage.
Nitrogen supplementation may contribute to higher tolerance of S. cerevisiae strains to the different deleterious conditions, such as those that are faced in the Brazilian ethanol production. The present stud y evaluated the influence of amino acid supplementation under the growth and cell viability of CAT- 1 industrial strain under conditions of ethanolic and osmotic stress (YNB medium with 10 and 12% v/v ethanol and molasses must with 15, 20, 25 and 30% ART). Amino acid supplementation was also evaluated in fermentations of sugarcane molasses and syrup, using cell recycle. The results revealed that amino acid supplementation caused distinct effects on the physiological behavior of the yeast according to the medium/musts provided. Histidine supplementation favored the CAT-1 for higher growth and ce ll viability in molasses and syrup musts. The results showed that the supplementation of 200 mg.L-1 of amino acid can favor or degrade the growth and viability of the CAT-1 in fermentations simulating Brazilian industrial conditions. Supplementation with histidine proved to be the most promising for increasing the tolerance of the industrial strain.
R E S U M O
Palavras- chaves
histidina
suplementação de aminoácidos
fermentação alcoólica S. cerevisiae
A suplementação de fontes nitrogenadas pode contribuir para maior tolerância de linhagens de S. cerevisiae frente às diversas condições deletérias, como as que são enfrentadas no processo brasileiro de produção de etanol. O presente estudo avaliou a influência da suplementação de aminoácidos sob o crescimento e a viabilidade celular da linhagem industrial CAT-1 em condições de estresse etanólico e osmótico (meio YNB com 10 e 12% v/v de etanol e mosto de melaço com 15, 20, 25 e 30% de ART). A suplementação de aminoácidos também foi avaliada em fermentações de melaço e xarope de cana-de - açúcar, empregando reciclo (reaproveitamento) de células. Os resultados revelaram que a suplementação com aminoácidos ocasionou efeitos distintos no comportamento fisiológico da levedura de acordo com o meio/mosto fornecido. A suplementação com histidina favoreceu a linhagem CAT-1 para maior crescimento e viabilidade em mostos provenientes tanto de melaço quanto de xarope. Os resultados
revelaram que a suplementação de 200 mg.L-1 de nitrogênio amínico proveniente de aminoácidos, adicionada aos diferentes mostos, pode favorecer ou depreciar o crescimento e viabilidade da linhagem CAT-1 em fermentações simulando as condições industriais brasileiras. A suplementação com histidina se mostrou a mais promissora para o aumento da tolerância da linhagem industrial CAT- 1.
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INTRODUÇÃO
Compreender os fatores que interferem o pro- cesso de produção de etanol é de fundamental im- portância para contemplar uma fermentação com alta taxa de sobrevivência celular, desempenho fer- mentativo e consequentemente rendimento satisfa- tório (Basso et al., 2011; Lopes et al., 2016). Um a condição nutricional adequada pode favorecer as células de levedura, tornando-as aptas a sobreviver aos efeitos deletérios, encontrados durante a fer- mentação (Tropea et al., 2016). Além de açúcares fermentescíveis e compostos inorgânicos, o nitro- gênio é um componente essencial para as células (Albers et al., 1996). Nesta conjuntura, a fonte de nitrogênio disponível no substrato durante o pro- cesso fermentativo tem influência direta sob o me- tabolismo e a fisiologia da levedura (Kalmokoff e Ingledew et al., 1985; Thomas e Ingledew, 1990; Basso et al., 2011). A tolerância, o cresci- mento/multiplicação celular, e, por conseguinte, o rendimento fermentativo do processo são exemplos de fatores influenciados pela disponibilidade de ni- trogênio no meio (Thomas e Ingledew, 1990). Tam- bém é proposto que em S. cerevisiae a limitação de nitrogênio nas fermentações pode ocasionar a ina- tivação de proteínas trasportadoras de sacarose (Ba- dotti et al., 2008), sendo este o açúcar mais abun- dante no substrato empregado no processo brasi- leiro (Peters, 2006).
As várias fontes de nitrogênio usadas por leve- duras são qualitativamente referidas como sendo preferidas ou não preferidas. Esta classificação foi empiricamente baseada em dois critérios: o pri- meiro é o quão bem os compostos individuais su- portam o crescimento quando presentes como única fonte de nitrogênio, e o segundo critério reflete a descoberta de que as fontes preferenciais de nitro- gênio geralmente provocam a repressão dos proces- sos necessários para a utilização de fontes de nitro- gênio não preferidas (Magasanik e Kaiser, 2002). Leveduras S. cerevisiae preferencialmente utili- zam o nitrogênio na forma amoniacal (NH4+) e, a partir do íon amônio, sintetizam todos os aminoáci- dos e bases nitrogenadas, necessários ao seu cresci- mento. Em condições de carência do íon amônio, o N amídico (na forma de ureia, por exemplo) ou amínico (na forma de aminoácidos) podem ser me- tabolizados por outras vias de utilização em S. ce- revisiae (Basso e Amorim, 2001). O nitrogênio contido no caldo de cana puro está majoritaria- mente disponível na forma assimilável, no entanto, é insuficiente para suprir a nutrição celular da leve- dura (Chen, 1993; Jeronimo et al., 2008). A suple- mentação com o sulfato de amônio ou com a ureia tem sido requerida pela indústria alcooleira por re-
presentarem fontes de N mais econômicas. Con- tudo, apesar da suplementação com a ureia pouco afetar o pH do meio, a utilização do sulfato de amô- nio aumenta a acidez do meio externo, diminuindo a viabilidade e a multiplicação das células (Amorim et al., 1996). Estudar possíveis fontes de N e suas respectivas concentrações adequadas ao processo é de extrema relevância para aumentar as opções de suplementação atualmente disponíveis para a in- dústria. Ademais, alguns resíduos agroindustriais contêm altas concentrações de nitrogênio, torná- los um subproduto seria uma proposta promissora para o desenvolvimento sustentável (Woiciechowski et al., 2013). Para isso, seria preciso estudos extensi- vos sobre a ação das diferentes fontes de N assimi- láveis pela levedura em substratos atualmente em- pregados nos processos de produção do bioetanol. Acapacidade de usar aminoácidos e outros com- postos nitrogenados requer sua internalização e, consequentemente, as células de leveduras pos- suem múltiplas permeases para facilitar seu trans- porte através da membrana citoplasmática (Ljung- dahl, 2009). A presença de aminoácidos no meio induz a expressão de várias permeases de especifi- cidade ampla; portanto, os aminoácidos induzem a sua própria absorção. Esta resposta da transcrição é mediada pelo sensor Ssy1-Ptr3-Ssy5 (SPS) locali- zado na membrana citoplasmática (Ljungdahl, 2009).
Os aminoácidos podem ser referidos como uni- dades de construção, uma vez que desempenham funções vitais para a célula, como a síntese de en- zimas e de componentes estruturais (Takagi et al., 1997; Morita et al., 2002). Segundo Hu et al. (2005) os aminoácidos isoleucina, metionina e fenilalanina podem aumentar a tolerância de S. cerevisiae em condição de estresse etanólico. De acordo com os autores, a maior tolerância das células foi decor- rente da incorporação dos aminoácidos suplemen- tares na membrana citoplasmática, o que possivel- mente levou à maior capacidade de neutralizar o efeito de fluidização exercido pelo etanol.
Outro estudo identificou que uma linhagem so- bre expressando a prolina também apresentou maior viabilidade em condições de estresse alcoó- lico e, além disso, maior resistência ao congela- mento, dessecação e estresse oxidativo foi obser- vada (Takagi, 2008). Asuplementação com o ácido glutâmico também tem sido apontada por gerar be- nefícios às células de S. cerevisiae, uma vez que promoveu um crescimento maior e mais acelerado em substrato derivado de trigo (Thomas e Ingle- dew, 1990). Sendo assim, é possível hipotetizar que alguns aminoácidos podem atuar não somente como fonte de N, mas também como um consti- tuinte protetor de membrana, aumentando a viabili- dade celular da levedura em situações adversas,
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como as que são encontradas no processo industrial da produção de etanol (Hu et al., 2005). Embora existam estudos relatando a influência dos aminoá- cidos na fisiologia de S. ceresisiae, submetida a di- ferentes condições de estresse, estudos destacando a ação dos mesmos atuando individualmente em fermentações de mostos derivados de cana-de- açú- car ainda são escassos.
Neste contexto, o presente estudo teve por obje- tivo avaliar a suplementação de nitrogênio amínico proveniente de aminoácidos no crescimento e via- bilidade celular da levedura industrial CAT-1 em
mostos de melaço e xarope de cana-de- açúcar. MATERIAL E MÉTODOS
Material biológico
A linhagem industrial CAT-1 foi empregada no decorrer de todo o presente estudo, no qual realiza- ram-se testes de crescimento em microescala e ex- perimentos fermentativos com reciclo de células, no intuito de avaliar a suplementação de 200 mg.L - 1 de N amínico proveniente de aminoácidos. Tal li- nhagem de levedura foi obtida/selecionada por Basso et al. (2008). Oexperimento foi inteiramente conduzido no Laboratório de Bioquímica e Tecno- logia de Leveduras da Escola Superior de Agricul- tura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo (ESALQ/USP).
Testes de crescimento em microescala
Testes de crescimento em microescala foram re- alizados em triplicata em um espectrofotômetro
TECAN (Densidade óptica/D.O. 600 nm), por in- cubação de microplacas de 96 poços em condições microaeróbicas com leituras em intervalos de 2 ho- ras a 30°C, durante o período de 48 horas. Agita- ções prévias de 5 minutos antes de cada leitura fo- ram realizadas. Para a montagem da microplaca, foi adicionado em cada poço:
• 20 μL de solução de cada aminoácido (com 1.200 mg.L-1 de Namínico), diluído com água e esterilizado em autoclave a 121°C por 20 minutos (Tabela 1);
• 10 μL de inóculo pré-crescido durante 48 horas em meio YEPD (2% D-glicose, 1% de extrato de levedura e 1% de peptona bacteriológica);
• 90 μL de mosto de melaço de cana com
diferentes concentrações de ART(%, p/v) e pH 5,0, ou 90 μL de meio YNB (0,93% YNB sem sulfato de amônio e aminoáci- dos, 2,70% D-glicose, 0,1% sulfato de amônio e 0,05% uréia) com diferentes ní- veis de etanol (%, v/v) e pH 5,0.
•
A concentração de cada aminoácido foi calcu- lada para contribuir com 200 mg.L-1 de N amínico em 120 μL, sendo este o volume final de cada poço de microplaca (Tabela 1). As concentrações de uréia e sulfato de amônio foram calculadas para contribuir juntas com um total de 200 mg.L-1 de N
amínico em um volume final de 120 μL. Os amino-
ácidos nas moléculas proteicas são sempre L- este- reoisômeros, portanto, somente foram utilizados L - aminoácidos.
Tabela 1 - Dados de peso molecular e concentração dos aminoácidos testados .
Aminoácidos
Peso mo- lecular
mg de N amí- nico.L-1 (por mili- mol.L-1 )
mmolL-1 para 1. 200 mg de N amínico.L- 1
(1200*14)
mgL-1 para 1.200 mg de N amínicoL- 1
(85,71*peso molecular)
g.L-1 para
1.200 mg de N amínico.L- 1
1 Alanina Ala 89,1 14 85,71 7637,14 7,64
2 Arginina Arg 210,7 14 85,71 18060,00 18,06
3 Asparagina Asn 132,1 14 85,71 11322,86 11,32
4 Aspartato ou ácido aspártico Asp 133,1 14 85,71 11408,57 11,41
5 Cisteína Cys 175,6 14 85,71 15051,43 15,05
6 Fenilalanina Phe 165 14 85,71 14142,86 14,14
7 Glicina ou Glicocola Gly 75,1 14 85,71 6437,14 6,44
8 Glutamato ou ácido glutâmico Glu 147,1 14 85,71 12608,57 12,61
9 Glutamina Gln 146 14 85,71 12514,29 12,51
10 Histidina His 155 14 85,71 13285,71 13,29
11 Isoleucina Ile 131,2 14 85,71 11245,71 11,25
12 Leucina Leu 131,2 14 85,71 11245,71 11,25
13 Lisina Lys 182,7 14 85,71 15660,00 15,66
14 Metionina Met 149,21 14 85,71 12789,43 12,79
15 Prolina Pro 115,13 14 85,71 9868,29 9,87
16 Serina Ser 105,1 14 85,71 9008,57 9,01
17 Tirosina Tyr 181,2 14 85,71 15531,43 15,53
18 Treonina Thr 119,1 14 85,71 10208,57 10,21
19 Triptofano Trp 204,2 14 85,71 17502,86 17,50
20 Valina Val 117,2 14 85,71 10045,71 10,05
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Determinação de N assimilável em melaço de cana-de- açúcar
A dosagem de N assimilável (N amínico + N amoniacal) pela levedura foi determinada em mosto de melaço de cana com 10% de ART. Inicialmente, o pHdo mosto foi ajustado para 8,0 com NaOH (1,0 mol.L-1), e adicionou-se 10 mL de BaCl2 (1,0 mol.L-1). Após 15 minutos, todo o volume foi adi- cionado em balão volumétrico de 200 mL, onde se completou o volume com água desmineralizada. Todo o conteúdo do balão foi filtrado com papel filtro, desprezando os primeiros 10 mL. Do filtrado transferiu-se 100 mL para um béquer, o pH foi no- vamente ajustado para 8,0 (NaOH, 1,0 mol.L-1) e adicionou-se 25 mL de formaldeído com pH tam- bém ajustado para 8,0. Por meio de titulação de NaOH (1,0 mol.L-1), e anotação do volume gasto, calculou-se a concentração de N assimilável (Fi-
lipe-Ribeiro e Mendes-Faia, 2007).
Preparação de mostos a partir de melaço e xarope de cana-de-açúcar com suplementação de aminoácidos
Os mostos oriundos do melaço ou xarope de cana-de-açúcar, utilizados nos experimentos fer- mentativos com reciclo de células, foram prepara- dos a partir de diluição do melaço/xarope com água, para obter a porcentagem (%, p/v) de ART desejada. Os mostos diluídos foram centrifugados a 10.000 rpm, sob 20°C, durante 20 minutos e distri- buídos em frascos erlenmeyer, os quais foram este- rilizados a 121ºC por 25 minutos. Paralelam ente, preparou-se em frascos erlenmeyer de 50 mL, uma solução de cada aminoácido contendo 2000 mg.L- 1
de N amínico em 15 mL de água destilada, esterili- zados a 121ºC por 25 minutos.
Em câmara de fluxo, toda a solução estéril de cada L-aminoácido foi adicionada separadamente em garrafas pet com capacidade de 350 mL (previ- amente esterilizadas com água sanitária 10% e en- xaguadas com água destilada), adicionando-se em seguida 135 mL de mosto de melaço ou xarope. A concentração dos aminoácidos foi calculada para 200 mg.L-1 de N amínico, obtendo-se 150 mL de volume final de mosto em cada garrafa pet. Os mos- tos foram estocados em congelador e degelados di- ariamente para a utilização em cada ciclo.
Propagação de biomassa de levedura para experimentos fermentativ os
Para a propagação de biomassa, 150 μL da cul- tura previamente armazenada em ultra-freezer (em solução com 20% de glicerol) foram transferidos para 2 tubos contendo 5 mLde meio YEPD (2% D -
glicose, 1% de extrato de levedura e 1% de peptona bacteriológica) sob incubação a 28°C, durante 48 horas. Após o crescimento, todo o conteúdo dos tu-
bos foi transferido para 2 frascos erlenmeyer con- tendo 150 mLde mosto de melaço de cana da Usina São Manoel com 10% de ART, pH 4,5, incubação a 30°C, durante 48 horas. Posteriormente, o conte- údo total de cada erlenmeyer foi transferido para 2 frascos erlenmeyer contendo 1,2 L do mesmo mosto acima mencionado. Os frascos foram incu- bados a 30°C, durante o período de 72 horas. Em seguida, a biomassa úmida foi resgatada por centr i- fugação (4000 rpm) para a condução do primeiro ciclo de fermentação. Todo o procedimento de pro- pagação e resgate de biomassa úmida foi repetido para os experimentos fermentativos com reciclo de células.
Experimentos fermentativos com
suplementação de aminoácidos e reciclo de células
Foram conduzidos dois experimentos fermenta- tivos com reciclo de células, nos quais se empregou tubos de fundo cônico (Falcon) com capacidade de 15 mL. No primeiro experimento, com duas repeti- ções para cada tratamento com aminoácido (200 mg.L-1 de N amínico), empregou-se mosto de me- laço da Usina Açucareira São Manoel. No segundo, com três repetições para cada tratamento (200 mg.L-1 de N amínico de aminoácido), empregou- se xarope de cana-de-açúcar da Usina São Martinho. Em ambos os experimentos, para o inóculo do primeiro ciclo fermentativo, coletou-se por centri- fugação (4.000 rpm) a biomassa da linhagem CAT - 1 da etapa de propagação, de modo que todos os tratamentos iniciassem o primeiro ciclo com o mesmo teor (g) de fermento (0,85 g no primeiro ex- perimento e 0,76 g no segundo). Posteriormente, adicionou-se 8 mL de mosto de melaço, no caso do primeiro experimento e xarope de cana, no caso do segundo. As fermentações foram conduzidas a 30°C. Os tubos foram mantidos em incubação a 30°C pelo período de 8 horas, e posteriormente fo- ram mantidos na bancada em temperatura ambi- ente, até a realização do ciclo subsequente, no dia posterior. Ao final de cada ciclo fermentativo, a bi- omassa de levedura foi separada do substrato fer- mentado por centrifugação (4.000 rpm) e pesada.
Então, adicionou-se 8 mL de mosto, conforme as
condições acima descritas. Todo o procedimento foi repetido sucessivamente em 7 reciclos no pri- meiro experimento fermentativo, e em 3 reciclos no
segundo. A concentração de ART (%, p/v) do mosto foi aumentada gradualmente ao longo do pri- meiro experimento, onde os mostos tinham concen-
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trações de 12, 15 e 20% de ART. No segundo ex- perimento, no qual se utilizou xarope de cana, a concentração de ART foi de 20%. Ao final de todos os ciclos mediu-se: o teor de etanol (%, v/v) do vi- nho delevedurado, o peso da biomassa (g) e a via- bilidade celular (%).
Determinação de biomassa
Os tubos de fundo cônico vazios foram pesados antes de iniciar os experimentos de fermentação com reciclo de células. Ao final de cada ciclo, após a separação dos vinhos, a biomassa úmida precipi- tada foi pesada (g), e por diferença de peso do tubo com e sem fermento, foi determinado o teor de bi- omassa úmida ao final de cada ciclo fermentativo.
Determinação de etanol
Foram transferidos 5 mL do vinho delevedurado para o interior de um microdestilador Kjeldahl (Pi- racicaba, Brasil). A partir da destilação por arraste de vapor, foi recolhido o material condensado em um balão volumétrico de 50 mL, até completar o volume. As amostras destiladas foram transferidas para um densímetro digital Anton-Paar DMA- 48 (Graz, Áustria) para a estimativa do teor de etanol (%, v/v). O valor gerado pelo densímetro foi multi- plicado por 10 de modo a compensar a diluição ocorrida na etapa de destilação.
Determinação de viabilidade celular
A viabilidade celular foi estimada em porcenta- gem por microscopia óptica, em objetiva de 40x, por coloração diferencial de células, utilizando- se uma solução de eritrosina em tampão de fosfato. As células viáveis (não coradas) e as células não viá- veis (coradas de rosa) foram contadas com auxílio de uma câmara de Neubauer. A viabilidade foi ex- pressa em função da proporção de células viáveis sobre o total de células contadas (viáveis e não viá- veis) (Oliveira et al., 1996).
Análises estatísticas
Foram realizadas análises de variância (ANOVA) e testes de comparação de médias de Tukey no software R. As médias referentes às repe- tições de cada tratamento foram consideradas dife- rentes ao nível de 5% de significância (p<0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Testes de crescimento em meio YNB com etanol
O principal objetivo dos testes, nos quais se em- pregou meio YNB contendo 10 e 12% de etanol (v/v), foi avaliar a influência da suplementação dos aminoácidos no crescimento da linhagem CAT- 1
quando exposta aos níveis de etanol encontrados na indústria. De acordo com Basso et al. (2008) na in- dústria do etanol, o caldo ou o melaço de cana de açúcar, utilizados como substratos no processo, re- sultam em produções nas concentrações de etanol de 8-11% (v/v) dentro de um período de 6-11 horas a 32- 35°C.
Os testes de crescimento (D.O. 600 nm) em meio YNB suplementado com 200 mg.L-1 de N amínico
proveniente de aminoácido revelou que, quando o tratamento foi de 10% de etanol (v/v), no período de 48 horas somente o ácido aspártico (0,760) con- feriu maior crescimento em relação ao controle (0,713) sem a suplementação de aminoácido (con- trole 1) (Figura 1). No entanto, a análise estatística revelou que estes valores de D.O. final (Asp e con- trole 1) não representam diferenças significativas.
Sendo assim, no teste com 10% de etanol, nenhum aminoácido conferiu maior crescimento em relação ao controle 1, sem a suplementação.
Na figura 1, o Controle 1 refere-se a D.O. em meio YNB com 10% de etanol (v/v) sem a adição de aminoácido no mesmo período. OControle 2 re- fere-se a D.O. emmeio YNBsem a adição de etanol e aminoácido no mesmo período. Letras iguais não diferem ao nível de 5% de significância (p<0,05), de acordo com o teste de Tukey. Análises estatísti- cas só foram calculadas para os tratamentos com etanol. Neste mesmo meio, YNB, sem a adição de aminoácido e de etanol (controle 2), a linhagem
CAT-1 apresentou uma D.O. de 0,881 no período de 48 horas (Figura 1). No que se refere à depreci- ação do crescimento, 11 aminoácidos conferiram menor crescimento em relação ao controle 1, s endo estes: Leu, Pro, His, Ile, Val, Tyr, Met, Lys, Thr, Gln e Cys. A suplementação com Cys causou um crescimento significativamente menor em relação a todos os outros aminoácidos e controles 1 e 2, su- gerindo que possivelmente este aminoácido pode ter sido tóxico para a levedura nestas condições, uma vez que quase não houve crescimento após 48 horas (D.O. 0,012) (Figura 1).
Por outro lado, quando o teor de etanol foi de 12% (v/v) no meio YNB, a suplementação de gli- cina (0,636) e de fenilalanina (0,588) inc rementa- ram significativamente o crescimento em relação ao controle 1 (0,430) após 48 horas (Figura 2). A glicina é um aminoácido aquiral pequeno que de- sempenha um papel importante no metabolismo de carbono das células de levedura (Piper et al., 2000). Portanto, desempenha um papel importante no su- porte a divisão celular (Wu 2009). As três rotas pri- márias de glicina são o metabolismo e a formação de serina via serina hidroximetiltransferase, a des-
carboxilação oxidativa através do sistema de cliva- gem da glicina (glicina sintase), e a formação de bases de nucleotídeos (Sinclair e Dawes, 1995).
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Figura 1 - Dados de D.O. (600nm) final e análises estatísticas da linhagem CAT-1 às 48 horas em meio YNB com 10% de etanol (v/v) e suplementação de aminoácidos (200 mg.L-1 de N amínico).
Tem sido proposto que a fenilalanina é necessária para o crescimento ótimo de S. cerevisiae em meios sintéticos (Hanscho et al., 2012; Crépin et al., 2012). Leveduras S. cerevisiae sintetizam fenilala- nina e tirosina através do intermediário 4- hidroxi- fenilpiruvato e fenilpiruvato, respectivamente. A fenilalanina normalmente tem apenas três destinos metabólicos: incorporação em cadeias de polipépti- dos; produção de tirosina através da hidroxilase de fenilalanina, que requer a tetrahidrobiopterina; e conversão para um álcool fusel (fusel oil). S. cere- visiae degrada os aminoácidos aromáticos (tripto- fano, fenilalanina e tirosina) e os aminoácidos de cadeia ramificada (valina, leucina e isoleucina) através da via de Ehrlich. Esta via consiste em 3 etapas: 1) desaminação do aminoácido para o ácido alfaceto correspondente; 2) descarboxilação do
ácido alfaceto resultante do aldeído; e 3) redução do aldeído para formar o álcool de cadeia longa ou complexo correspondente, conhecido como álcool fusel ou óleo fusel (Braus, 1991). Oóleo fúsel pode ser empregado como solvente na indústria de cos- méticos e medicamentos, sendo sua principal apli- cação na obtenção do álcool isoamílico para a sín- tese de acetato de amila ou isoamila (fixador para perfumes) (Güvenç et al., 2007). Na figura 2, O Controle 1 refere-se a D.O. em meio YNB com 12% de etanol (v/v) sem a adição de aminoácido no mesmo período. O Controle 2 refere-se a D.O. em meio YNB sem a adição de etanol e aminoácido no mesmo período. Letras iguais não diferem ao nível de 5% de significância (p<0,05), de acordo com o teste de Tukey. Análises estatísticas só foram cal- culadas para os tratamentos com etanol .
Figura 2 - Dados de D.O. (600nm) final e análises estatísticas da linhagem CAT-1 às 48 horas em meio YNB com 12% de etanol (v/v) e suplementação de aminoácidos (200 mg.L-1 de N amínico).
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Umestudo relatou que quando as células de uma linhagem pertencente à espécie S. cerevisiae foram expostas a 20% de etanol (v/v), durante 9 horas a 30ºC, todas as células morreram. No entanto, 57% das células permaneceram viáveis quando a solução de etanol continha três aminoácidos: isoleucina, metionina e fenilalanina (Hu et al., 2005). Com base nas análises de composição de aminoácidos e fluidez de membrana citoplasmática, por meio de anisotropia de fluorescência, usando difenil- he- xatrieno como sonda, revelou-se que o aumento da tolerância ao etanol nas células de levedura foi de- vido à incorporação dos aminoácidos suplementa- res nas membranas citoplasmáticas, o que possivel- mente levou à maior capacidade de neutralizar o efeito de fluidização exercido pelo etanol (Hu et al.,
2005).
Sem a adição de etanol e aminoácido, CAT- 1 apresentou uma D.O. de 0,924 neste mesmo perí-
odo. A suplementação com cisteína causou o mesmo padrão de comportamento encontrado no teste anterior com 10% de etanol (Figura 1), pois com 12% de etanol (v/v), a linhagem apresentou uma D.O. de 0,003 (Figura 2). Isto ressalta a possi- bilidade de que a cisteína pode ter sido tóxica para a linhagem nestas condições. De acordo com Ono et al. (1999), linhagens de S. cerevisiae possuem vários mecanismos regulatórios para evitar a sobre- produção de cisteína e é provável que esta seja tó- xica para a célula por conter um grupo -SH (com- posto organossulfurado) altamente reativo. Se- gundo o autor, a adição de cisteína a uma concen- tração de 50 µM, isto é 0,700 mgL-1 de N amínico, provocou retardo e diminuição no crescimento, comportamento este atribuível à baixa atividade de transporte e assimilação de sulfato.
A adição de valina no meio YNB com 12% de etanol também causou depreciação no cresci- mento, sendo que não houve diferenças entre valina (0,147) e cisteína no período de 48 horas. Derrick & Large (1993) sugerem que uma quantidade sig- nificativa de valina pode ser metabolizada por rotas diferentes da via de Ehrlich, possivelmente por meio da ação de desidrogenase de cetoácidos de ca- deia ramificada. Tais autores sugerem que a quebra de valina requer mais energia, sendo que no estudo dos mesmos foi obtido um rendimento de cresci- mento significativamente menor de S. cerevisiae em meio com valina como única fonte de N. Vale ressaltar que nem todas as enzimas envolvidas no metabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada em leveduras ainda foram identificadas, nem suas interações foram adequadamente compreendidas. Em síntese, a adição dos aminoácidos Lys, His, Thr, Met, Ile, Val e Cys no meio YNB com 12% de etanol ocasionou uma diminuição significativa da D.O. (48 horas), em relação ao controle 1 (Figura
2). Ao verificar os dados revelados pelos testes com 10 e 12% de etanol (v/v), é possível sugerir que a suplementação com os diferentes aminoácidos pode causar comportamentos distintos, aumen- tando ou depreciando o crescimento, inclusive sob influência da concentração de etanol encontrada no meio YNB. Vale ressaltar que os aminoácidos não foram adicionados como única fonte de N no meio YNB. Sendo assim, os dados de crescimento aqui obtidos sofreram influência não somente da con- centração de etanol fornecido, mas também do sul- fato de amônio e ureia adicionados ao meio (0,1% e 0,05%, respectivamente).
Testes de crescimento e determinação de nitrogênio assimilável em mosto de melaço de cana-de- açúcar
Os testes nos quais se empregou o mosto de me- laço de cana-de-açúcar foram realizados para ava- liar tanto a influência dos aminoácidos no cresci- mento da linhagem CAT-1 em mostos com diferen- tes concentrações, quanto selecionar uma concen- tração adequada para os ensaios fermentativos sub- sequentes. No entanto, foi necessário verificar a do- sagem de nitrogênio assimilável, isto é, N amínico mais N amoniacal, a fim de determinar uma con- centração adequada para a suplementação dos ami- noácidos nos testes de crescimento em melaço. A determinação de N assimilável revelou uma con- centração de 227 mgL-1 em mosto proveniente do melaço da usina São Manoel, com 10% de ART. De acordo com Amorim et al. (1996), leveduras S. cerevisiae possuem um teor de N de 8%, com base na matéria seca, constituindo as moléculas de aminoácidos, proteínas, enzimas, ácidos nucléicos, purinas, primidinas, pigmentos respiratórios (cito- cromos), vitaminas, etc. Em meio YEPD (2% D - glicose, 1% de extrato de levedura e 1% de peptona bacteriológica) a levedura atinge uma biomassa úmida de cerca de 2%, isto significa que é possível obter 20 g.L-1 de biomassa úmida, ou 5 g.L-1 de bi- omassa seca (25% da massa úmida). Portanto, 0,4 g.L-1 de Ncorrespondem a 5 g.L-1 de biomassa seca, isto ao considerar que a levedura possui o teor de 8% de N, conforme descrito acima.
No crescimento aqui realizado, optamos por uti- lizar mostos de melaço de cana visando uma apro- ximação das condições encontradas nas destilarias brasileiras. Consideramos um teor final de 3% de biomassa úmida, e que para tal seria necessário 0,6 g.L-1 de N. Sabendo que o mosto da usina São Ma- noel (10% de ART) possui 227 mgL-1 de N assimi- lável, e que a levedura precisa de 600 mgL-1 de N para crescer 3%, optamos por suplementar os mos- tos de melaço nos testes de crescimento com 200
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mgL-1 de N amínico proveniente dos diferentes aminoácidos. Desta forma, seria possível conce n- trar o mosto, levando em consideração que se au- mentarmos a concentração do mosto, também esta- ríamos aumentando a concentração de N. Além disso, segundo Amorim &Leão (2005), a utilização da concentração de N assimilável (NH4+ e R-NH2 ) recomendada em mostos no processo fermentativo é de 100-300 mgL-1 .
O teste de crescimento empregando o mosto de melaço de cana com 15% de ART revelou que a suplementação com Val (1,323) promoveu cresci- mento significativamente maior em relação ao con- trole (D.O. 1,059), após 48 horas de crescimento. Embora a presença da cisteína também tenha oca- sionado depreciação no crescimento (0.909) no mosto de melaço, os dados não revelaram diferen- ças estatísticas em relação ao controle no mesmo período (48h) (Figura 3A). Estes resultados permi- tem compreender que o meio utilizado pode alterar totalmente o efeito da suplementação, aumentando
ou diminuindo o crescimento da linhagem testada. Ou seja, o efeito no crescimento promovido por um aminoácido pode ser alterado, isto porque tal efeito pode ter influência do meio. É importante destacar que, em S. cerevisiae, as vias metabólicas envolvi- das na síntese e utilização dos aminoácidos envol- vem muitas vezes a presença de outros aminoáci- dos, revelando um mecanismo complexo e intrin- cado (Ljungdahl & Daignan-Fornier, 2012). Se- gundo Clement et al. (2013), alterações metabóli- cas particulares podem ser desencadeadas de acordo com a natureza do aminoácido fornecido, além da resposta comum. A presença de alguns aminoácidos específicos pode favorecer a ut iliza- ção de outros. Por exemplo, no presente estudo a suplementação com valina depreciou o crescimento em YNB com 10 e 12% de etanol (Figuras 1 e 2), e por outro lado, promoveu maior crescimento em mosto de melaço de cana com 15% de ART (Figura 3A).
Figura 3 - Dados de D.O. (600nm) final e análises estatísticas da linhagem CAT-1 às 48 horas em mosto de melaço com 15% (A) e 20% (B) de ART e suplementação de aminoácidos (200 mgL-1 de N amínico). O controle refere-se a D.O. sem a adição de aminoácido no mesmo período. Letras iguais não diferem ao nível de 5% de significância (p<0,05) .
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Portanto, descrever os diferentes efeitos no cres- cimento, promovidos pelos aminoácidos em mosto de melaço, possivelmente ajudaria a responder quais aminoácidos poderiam surtir efeitos positivos ou até mesmo negativos para a fermentação. O crescimento não é um fator primordial no tocante ao processo biotecnológico onde se emprega grande densidade de células, no entanto, é um indi- cativo de estresse em condições onde há pouca dis- ponibilidade de oxigênio. Em condições microae- róbicas tais quais foram empregadas no presente trabalho (ensaios em microplacas), a linhagem pode apresentar menor crescimento, ou até mesmo nenhum, uma vez que o meio esteja promovendo efeitos deletérios para as células, como foi obser- vado a partir da suplementação com Cys.
Oteste de crescimento em mosto de melaço com 20% de ART revelou que a presença da cisteína de- preciou significativamente o crescimento (D.O.
0,797) da linhagem CAT-1 no que se concerne ao controle sem a suplementação de aminoácido (D.O. 1,001) (Figura 3B). Os dados obtidos por todos os testes de crescimento aqui realizados apresentaram uma correlação no que diz respeito a supleme nta- ção com Cys. Tanto no meio YNB com 10 e 12% de etanol (%, v/v) (Figuras 1 e 2), quanto em mosto de melaço com 20% de ART (Figura 3B), a linha- gem CAT-1 apresentou crescimento significativa- mente menor quando suplementada com 200 mgL - 1 de N amínico proveniente de Cys. Estes resulta- dos enfatizam o trabalho de Ono et al. (1999), onde o mesmo ressaltou que é provável que a cisteína seja tóxica para a célula de S. cerevisiae devido à sua posse de um grupo -SH altamente reativo.
Em mosto com 20% de ART, nenhuma outra su- plementação, além de Cys, revelou diferença signi-
ficativa em relação ao controle. Possivelmente o aumento da concentração do mosto levou a uma maior concentração de N total assimilável pela le- vedura. Este aumento pode ter contribuído para a disponibilidade máxima de N assimilável necessá- ria. Sendo assim, pode-se inferir que por este mo- tivo não foram observadas diferenças significati- vas, no que se refere ao propósito de maior cresci- mento da linhagem CAT-1 em relação ao controle sem a suplementação de aminoácido. Foram avali- adas concentrações ainda maiores, de 25 e 30% de ART no mosto de melaço. Os resultados não reve- laram diferenças significativas referente ao cresci- mento de CAT-1 sem e com a suplementação de 200 mgL-1 de N amínico proveniente de ami noá- cido (Figuras suplementares 1 e 2). Portanto, o au- mento da concentração do mosto de melaço, a partir de 15% de ART, possivelmente pode propiciar me- nor influência da suplementação de aminoácidos no crescimento da linhagem CAT-1 nas condições aqui empregadas. Entretanto, além do crescimento,
outros parâmetros podem ser avaliados para a veri- ficação da interferência da presença dos aminoáci- dos durante a fermentação alcoólica, e até mesmo validar o seu possível emprego no processo. Os pa- râmetros produção de etanol e viabilidade celular, por exemplo, também são fundamentais para ava- liar o efeito dos diferentes aminoácidos na linha- gem testada. Além disso, o teor de N da levedura com base na matéria seca é de 8%, porém em leve- duras durante a fermentação alcoólica este teor é mais baixo, de 5-6% (Amorim et al., 1996). Por- tanto, nas fermentações posteriores com reciclo de células optamos por continuar a utilizar a concen- tração de 200 mgL-1 de N proveniente de aminoá- cidos, com a finalidade de avaliar os parâmetros de viabilidade celular e produções de biomassa e eta- nol.
Experimentos fermentativos com suple- mentação de aminoácidos e reciclo de célu- las: fermentações em mosto de melaço de cana-de- açúcar
A partir dos dados de D.O. obtidos pelos testes de crescimento em mosto de melaço, seis aminoá- cidos foram selecionados aleatoriamente dentre to- dos os que promoveram maior crescimento em re- lação ao controle, sem a suplementação de amino- ácido, sendo eles: Ala, Arg, His, Lys, Ser e Val. Sete fermentações consecutivas foram realizadas a fim de verificar a influência da suplementação, dos aminoácidos selecionados, na viabilidade celular (%), produção de biomassa (g) e produção de etanol (%, v/v), ao final de cada ciclo. A suplementação dos aminoácidos foi de 200 mgL-1 de N amínico, sendo que para todos os tratamentos com os dife-
rentes aminoácidos, a biomassa inicial foi de 0,85 g (Figura 4).
Com relação à produção de biomassa úmida (g), não houve diferenças significativas nos dois pri- meiros ciclos, pois para todos os tratamentos, com e sem a suplementação, a linhagem CAT-1 apresen- tou uma média de 1,06 g nos ciclos 1 e 2 (Figura 4). Nos ciclos posteriores, 3, 4, 5, 6 e 7, a suplementa- ção com Ala (1,17, 1,17, 1,19, 1,22 e 1,29 g) e His (1,17, 1,17, 1,17, 1,22 e 1,25 g) ocasionou cresci- mento significativamente maior em relação ao con- trole (1,03, 1,04, 1,04, 1,08 e 1,09 g) (Figura 4). A suplementação com Lys (1,15 e 1,19 g) também promoveu maior crescimento em relação ao con- trole nos ciclos 5 e 7. A presença de Arg, Ser e Val causou um crescimento significativamente igual ao controle em todos os ciclos fermentativos (Figura 4). Os dados de biomassa (g) demonstraram que a suplementação com Ala, His, e Lys estimulou maior crescimento da linhagem CAT-1 submetida em mosto de melaço de cana-de- açúcar.
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Figura 4 - Dados de produção de biomassa úmida (g) e análises estatísticas da linhagem CAT-1 em mosto de melaço de cana-de-açúcar com a suplementação de aminoácidos (200 mgL-1 de N amínico) ao final dos 7 ciclos fermentativos. O controle refere-se à biomassa (g) em mosto de melaço de cana-de-açúcar sem a suple- mentação de aminoácido. Letras iguais dentro do mesmo ciclo não diferem ao nível de 5% de significância (p<0,05)
Blomqvist et al. (2012) investigaram o efeito de diferentes aminoácidos sobre o número de gerações de uma espécie não-Saccharomyces (Dekkera bru- xellensis) em meio sintético sob condições anaeró- bicas. Neste estudo, corroborando os dados aqui obtidos, a suplementação com Ala (3,06), His (3,29) e Lys (3,51), também adicionada individual- mente ao meio, aumentou significativamente o nú- mero de gerações da levedura em comparação com o controle (1,04), sem a suplementação. Dawson (1965) mostrou que a presença de alanina aumen- tou a taxa de crescimento de uma linhagem de Can- dida utilis em uma cultura contínua com glicose como única fonte de carbono e limitação de NH4+. Em S. cerevisiae, a Ala é degradada através da transaminação para piruvato pela enzima alanina aminotransferase. O piruvato é transportado para a mitocôndria, onde é decarboxilado oxidativamente em dióxido de carbono e acetil-CoA pelo complexo piruvato desidrogenase e, então, acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico (Schlosser et al., 2004). Em condições respiratórias, a alanina aminotrans- ferase desempenha um papel central na biossíntese e degradação da arginina. Em condição fermenta- tiva, Saccharomyces cerevisiae sintetiza alanina por uma via alternativa, mas degrada a alanina pela mesma via a qual é produzida durante a respiração (García-Campusano et al., 2009).
Barton-Wright & Thorne (1949) relataram que a presença dos aminoácidos Lys e His como nutriente nitrogenado para a levedura S. cerevisiae é de inte- resse considerável. Isto porque em seu estudo, refe- rente à assimilação de 16 aminoácidos individuais em fermentação de mosto de cevada, verificou- se
que a estes aminoácidos foram os primeiros amino- ácidos a serem utilizados e, na conclusão da fer- mentação, foram assimilados praticamente por completo. Segundo os autores, as leveduras não po- dem remover o grupamento amino de Lys e His, sendo que a assimilação rápida, apesar de a leve- dura não realizar a desaminação dos mesmos, foi justificada pela hipótese de assimilação intacta de aminoácidos (Barton-Wright & Thorne, 1949).
A produção de etanol (%, v/v) foi igual para to- dos os tratamentos, com e sem aminoácidos. À me- dida que se adicionou sacarose, a partir do ciclo 4, o etanol também aumentou. Nos ciclos 1, 2 e 3, onde foram utilizados mostos com 12% de ART, para todas as suplementações e controle, observa- ram-se médias de produção de 6,34, 6,86 e 6,55% de etanol (v/v), respectivamente. Com o intuito de aumentar o estresse etanólico sem que ocorresse a concentração do melaço, foi adicionado 3% de sa- carose no ciclo 4, e 5% de sacarose nos ciclos pos- teriores (5, 6 e 7). O objetivo de aumentar a produ- ção de etanol foi ocasionar a diminuição do número de células viáveis e, deste modo, verificar se as di- ferentes suplementações de aminoácidos poderiam surtir efeitos na viabilidade da levedura. No ciclo 4, onde se empregou mosto com 15% de ART, a pro- dução de etanol foi de 8,09% (v/v). Nos ciclos 5, 6 e 7, em mostos com 20% de ART, os diferentes tra- tamentos e controle apresentaram médias de produ- ção de 10,31, 10,43 e 10,46% de etanol (v/v), res- pectivamente. Os dados de produção de etanol re- velaram que nas condições em que o experimento foi conduzido, as diferentes suplementações não al-
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teraram a produção de etanol em relação ao con- trole.
Em relação à viabilidade, a linhagem CAT-1 ini- ciou o primeiro ciclo com 100% de viabilidade para todas as suplementações e controle. Conforme es- perado e acima mencionado, a adição de açúcar a partir do ciclo 3 ocasionou queda no número de cé- lulas viáveis (Figura 5). Não houve diferenças sig- nificativas na viabilidade celular nos ciclos 1, 2 e 3, para todos os tratamentos as médias de viabilidade foram de 99,75, 99,53 e 98,80% (Figura 5). A su- plementação com 200 mgL-1 de N amínico prove- niente de Val apresentou valores de viabilidade de 93,14, 86,31, 75,51 e 61,01% nos ciclos 4, 5, 6 e 7, respectivamente, sendo estes valores significativa- mente menores em relação ao controle (99,64, 97,29, 90,81 e 78,82%) (Figura 5). A suplementa- ção com Ser, também ocasionou queda na viabili- dade a partir do ciclo 3. No entanto, diferenças es- tatísticas somente foram observadas no último ci- clo, onde este tratamento apresentou uma viabili- dade de 64,83%, significativamente menor em comparação com o controle 78,82% (Figura 5). As suplementações com Ala (98,89 e 86,80%), His
(99,41 e 99,10%) e Lys (98,18 e 86,94%) promo- veram os maiores valores de viabilidade nos ciclos 6 e 7, em relação ao controle (90,81 e 78,82%) e aos outros tratamentos (Figura 5). O tratamento com His promoveu viabilidade significativamente maior em relação ao controle no ciclo 7, sendo que esta suplementação promoveu os maiores valores de viabilidade em relação a todos os outros trata- mentos e controle nos dois últimos ciclos (6 e 7) (Figura 5). Em síntese, os dados obtidos pelo pre- sente experimento de fermentação revelaram que a presença de 200 mgL-1 de N amínico proveniente de Ala, His e Lys promoveram maior acúmulo de biomassa de CAT-1 em melaço de cana-de- açúcar (Figuras 4 e 5). A suplementação com Arg se mos- trou igual ao controle no que se refere aos parâme- tros de viabilidade (%), produção de etanol (%, v/v) e biomassa úmida (g) ao final de todos os sete ciclos (Figura 4 e 5). Isto sugere que a presença de Arg na concentração de 200 mgL-1 de Namínico, em meio proveniente de mosto de melaço da usina São Ma- noel, não surtiu efeitos nos principais parâmetros fermentativos analisados.
Figura 5 - Dados de viabilidade (%) e análises estatísticas da linhagem CAT-1 em mosto de melaço de cana - de-açúcar com a suplementação de aminoácidos (200 mgL-1 de Namínico) ao final dos 7 ciclos ferm entativos. O controle refere-se à viabilidade (%) em mosto de melaço de cana-de-açúcar sem a suplementação de amino- ácido. Letras iguais dentro do mesmo ciclo não diferem ao nível de 5% de significância (p<0,05) .
Segundo Jones & Fink (1982), em condições apropriadas, com carbono e NH4+suficientemente disponíveis, leveduras podem sintetizar todos os L - aminoácidos. As famílias de aminoácidos deriva- dos de uma molécula comum são facilmente iden- tificáveis e incluem a família glutamato (glutamato, glutamina, arginina, prolina e lisina); a família aro- mática (fenilalanina, tirosina e triptofano); a família
serina (serina, glicina, cisteína e metionina); a fa- mília aspartato (aspartato, asparagina, treonina e os aminoácidos que contêm enxofre cisteína e metio- nina); e a família dos piruvatos (alanina e aminoá- cidos ramificados valina, leucina e isoleucina). As vias de biossíntese de histidina e nucleotídeos estão conectadas. Aimportância do glutamato e da gluta- mina nas reações do núcleo central no metabolismo
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do nitrogênio é evidente, destacando seu envolvi- mento nas reações de transaminação necessárias na síntese de cada aminoácido (Magasanik & Kaiser, 2002; Ljungdahl & Daignan-Fornier, 2012 ).
Comrelação à suplementação de aminoácidos na fermentação alcoólica, leveduras tendem a acumu- lar o aminoácido fornecido e aqueles intimamente relacionados com ele metabolicamente, sendo que, uma concentração relativamente alta de ácido glu- tâmico é mantida na célula, independentemente da fonte de nitrogênio fornecida, refletindo o papel central do ácido glutâmico no metabolismo do ni- trogênio (Watson, 1976). No estudo de Pham & Wright (2008), a suplementação com uma mistura completa de aminoácidos (Complete S upplement Mixture of Sunrise Science Products) levou a res- postas celulares positivas de S. cerevisiae, inclu- indo a redução do tempo de latência e maior viabi- lidade celular, em meios contendo alta concentra- ção de açúcar (>200 g.L-1 de glicose). Além disso, verificou-se rendimentos de etanol aumentados (0,43 e 0,45 g de etanol por g de glicose) a partir da suplementação. Neste mesmo estudo, por meio de análise proteômica quantitativa, utilizada para en- tender como S. cerevisiae suplementada com ami- noácidos responde a condições de estresse osmó- tico, a maioria das proteínas envolvidas nas rotas da glicólise e pentoses fosfato tiveram suprarregula- ção (upregulation) em alta concentração de açúcar. A ativação do metabolismo de aminoácidos foi ob- servada no final da fase Lag. A abundância relativa das proteínas mais identificadas, incluindo proteí- nas de biossíntese de aminoacil-tRNA (RNA trans- portador ligado a um aminoácido) e proteínas de choque térmico, permaneceu inalterada nas horas imediatamente após a adição da glicose. No en- tanto, a expressão dessas proteínas aumentou signi- ficativamente no final da fase Lag. Além disso, também se verificou a suprarregulação das proteí- nas de biossíntese de trealose e glicogênio. Esses dados, combinados com as medições relevantes d os metabólitos, demonstram que a partir da suplemen- tação de aminoácidos é possível obter melhoria na fermentação alcoólica de meios com alta concen- tração de glicose por S. cerevisiae.
Fermentações em mosto de xarope de cana - de- açúcar
O xarope de cana-de-açúcar também pode ser utilizado em destilarias brasileiras e é constituído de menor quantidade de nutrientes e fonte de nitro- gênio em comparação com o melaço. Mais frequen- temente vem a ser a concentração do caldo de cana para se aumentar o teor de ART, sendo que tal subs- trato se assemelha ao xarope convenientemente di- luído para a fermentação. Por este motivo, também foram realizadas fermentações em mosto de xarope
a fim de avaliar a influência da suplementação de aminoácidos (200 mgL-1 de Namínico) nos pri nci- pais parâmetros da fermentação: biomassa (g), eta- nol (%, v/v) e viabilidade celular (%). Neste ensaio fermentativo, em apenas três ciclos já foram verifi- cadas diferenças significativas em relação à produ- ção de biomassa e viabilidade nos diferentes trata- mentos com aminoácidos. Tais diferenças possivel- mente foram observadas por ter sido empregado mosto de xarope a uma concentração de 20% desde o primeiro ciclo, para que fosse possível obter teo- res mais elevados de etanol e, por conseguinte, oca- sionar uma diminuição do número de células viá- veis. A partir dos dados obtidos pelo experimento fermentativo anterior, no qual se empregou mosto de melaço de cana-de-açúcar, foram selecionados os aminoácidos Ala, Lys e His, por terem favore- cido a linhagem CAT-1 em relação ao crescimento e a viabilidade (item 3.3.1). Os aminoácidos Asn, Glu e o Trp também foram selecionados para a fer- mentação em xarope de cana, pois a presença dos mesmos aumentou o crescimento de CAT-1 nos en- saios em microplacas, tanto em meio YNB com 12% (v/v) de etanol (Figura 2), quando em mosto de melaço com 15% de ART (Figura 3A). Além disso, o Trp e o Glu são aminoácidos bastante cita- dos na literatura por promoverem crescimento e re- sistência a diferentes tipos de estresse em S. cerevi- siae (Hirasawa et al., 2007; Yoshikawa, et al., 2009; Godin et al., 2016; Thomas &Ingledew, 1990; Ter - Schure et al., 1998; Wu et al., 2013 ).
Em todos os tratamentos a linhagem CAT-1 ini- ciou a primeira fermentação com 0,76 g de bio- massa úmida, coletada da etapa de propagação. Já no primeiro ciclo, a suplementação com His (1,04 g) ocasionou um crescimento significativamente maior do que o controle (0,92 g) e os demais trata- mentos analisados (Figura 6). A presença de Lys (0,98 g) também promoveu crescimento significa- tivamente maior do que o controle e não diferiu em relação a Ala (0,94) e Trp (0,95). No primeiro ciclo, Asn, Glu, Ala e Trp não diferiram do controle, sem a suplementação, em relação à produção de bio- massa em mosto de xarope de cana (Figura 6).
No segundo e terceiro ciclo a presença de His no xarope também promoveu maior crescimento (1,14 e 1,18 g) em comparação com o controle (1,06 e
1,06 g) e os demais tratamentos (Figura 6). Embora o glutamato tenha sido descrito na literatura como provedor de crescimento em leveduras S. cerevisiae (Hirasawa et al., 2007; Yoshikawa, et al., 2009; Go- din et al., 2016; Thomas & Ingledew, 1990; Ter - Schure et al., 1998; Wu et al., 2013), em mosto de xarope nas condições aqui descritas, o mesmo não ocasionou maior crescimento em relação ao con- trole em nenhum dos ciclos.
No ciclo 2, as suplementações com Glu, Ala,
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Asn e Trp apresentaram 0,97, 0,99, 1,03 e 1,03 g de biomassa, respectivamente, sendo estes valores sig- nificativamente menores do que o controle. A su-
plementação com Lys (1,05 g) não diferiu do con- trole com relação à produção de biomassa no se- gundo ciclo fermentativo (Figura 6).
Figura 6 - Dados de produção de biomassa úmida (g) e análises estatísticas da linhagem CAT-1 em mosto de xarope de cana-de-açúcar com a suplementação de aminoácidos (200 mgL-1 de N amínico) ao final dos 3 ciclos fermentativos. O controle refere-se à biomassa (g) em mosto de melaço de cana-de-açúcar sem a suple- mentação de aminoácido. Letras iguais dentro do mesmo ciclo não diferem ao nível de 5% de significância (p<0,05).
No terceiro e último ciclo, além da His ter pro- movido maior crescimento significativamente, a presença de Asn (1,11 g) também demonstrou maior produção significativa de biomassa úmida em relação ao controle. A suplementação com o Glu (0,97 g) apresentou menor acúmulo de bio- massa em relação a todos os outros tratamentos no último ciclo. Os aminoácidos Lys (1,04 g), Ala (1,01) e Trp (1,08) demostraram acúmulos de bio- massa similares ao controle, no ciclo 3 (Figura 6). Em síntese, a presença de His e Asn, em fermen- tações de xarope de cana, promoveu maior cresci- mento da linhagem CAT-1. Os dados de produção de biomassa sugerem que embora His também te- nha favorecido CAT-1 em fermentações de mosto de melaço, não há um padrão para o efeito dos tra- tamentos com os aminoácidos testados. Isto por- que, outros aminoácidos (Ala e Lys) apresentaram maior produção de biomassa em mosto de melaço em comparação com o controle, e por outro lado, apresentaram resultados similares ao controle no mosto de xarope de cana. Ou seja, ao alterar o mosto, com fonte de minerais e Ndiferentes, possi- velmente também se modifica o efeito dos aminoá- cidos, alterando o perfil fisiológico da levedur a. Não obstante, His promoveu maior crescimento da linhagem CAT-1 em ambos os mostos aqui testa- dos.
As análises de produção de etanol (%, v/v) não
revelaram diferenças significativas para os diferen- tes tratamentos com aminoácidos e o controle sem a suplementação. As médias de produção, conside- rando todos os aminoácidos e controle, para os ci- clos 1, 2 e 3 são de 11,61, 13,38 e 13,71% de etanol (v/v).
Com relação à viabilidade celular, todos os tra- tamentos, com e sem aminoácido, iniciaram a pri- meira fermentação em xarope com 100% de viabi- lidade. Ao contrário das fermentações em mosto de melaço de cana, a suplementação com Ala em xa- rope diminuiu a viabilidade celular de CAT-1 em todos os três ciclos: 90,67% no primeiro, 78,67% no segundo e 77,00% no terceiro (Figura 7). Este dado enfatiza a possibilidade de que os aminoáci- dos possam atuar de maneiras distintas de acordo com o mosto/meio utilizado.
No terceiro ciclo, a presença dos aminoácidos Trp (98,50), Asn (98,50) e His (95,00) apresenta- ram valores de viabilidade significativamente mai- ores em relação ao controle (86,00%) (Figura 7). A presença de Glu, mesmo que tenha apresentado me- nor acúmulo de biomassa (Figura 6), apresentou o valor de viabilidade de 85,50%, similar ao controle no último ciclo (Figura 7). A suplementação com Lys (88,40%) também não diferiu do controle no quesito viabilidade de células.
Em mosto de xarope, a suplementação com His
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e Asn favoreceu a linhagem em relação ao cresci- mento e viabilidade. No último ciclo, mesmo que a presença de Trp não tenha aumentado a produção
de biomassa, favoreceu a linhagem para a maior vi- abilidade em fermentações de xarope nas condições aqui empregadas.
Figura 7 - Dados de viabilidade (%) e análises estatísticas da linhagem CAT-1 em mosto de xarope de cana - de-açúcar com a suplementação de aminoácidos (200 mgL-1 de Namínico) ao final dos 3 ciclos fermentativos. O controle refere-se à viabilidade (%) em mosto de melaço de cana-de-açúcar sem a suplementação de amino- ácido. Letras iguais dentro do mesmo ciclo não diferem ao nível de 5% de significância (p<0,05) .
de-açúcar. Todos estes dados sugerem que a suple-
CONCLUSÕES
A concentração de 200 mgL-1 de nitrogênio amínico, utilizada nos diferentes tratamentos com aminoácidos, em meio YNB e em mostos de me- laço e xarope de cana, foi eficaz para o intuito de diferenciar comportamentos fisiológicos da linha- gem CAT-1. A partir dos dados obtidos - tanto pe- los testes de crescimento em microplacas, quanto pelas fermentações com reciclo de células - é pos- sível afirmar que a suplementação com aminoáci- dos pode ocasionar efeitos distintos no comporta- mento fisiológico da levedura CAT-1 de acordo com o meio/mosto empregado. Isto porque, alte- rando o meio verificou-se uma mudança comporta-
mental em relação ao crescimento e viabilidade da linhagem para a maioria dos aminoácidos testados. Possivelmente, isto se deve ao fato de que os ami- noácidos possuem vias metabólicas complexas, compreendendo um mecanismo intrincado, muitas vezes dependendo da presença de outros para que ocorra a sua assimilação/metabolização. Embora este comportamento tenha sido observado para a maior parte dos aminoácidos aqui testados, a suple-
mentação com His apresentou um padrão de com-
portamento, favorecendo a linhagem CAT-1 para maior crescimento e viabilidade em mostos prove- nientes tanto de melaço quanto de xarope de cana -
mentação com His poderia ser uma potencial fonte de N ou uma molécula protetora aos estresses en- contrados em fermentações de mostos de melaço e xarope de cana. Os resultados revelados pelo pre- sente estudo apontam que a suplementação de 200 mgL-1 de N amínico proveniente de alguns amino- ácidos, em mostos de melaço e xarope de cana, pode favorecer ou depreciar o crescimento e viabi- lidade da linhagem CAT-1 em fermentações simu- lando as condições industriais brasileiras, com reci- clo de células.
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