Sarmento-Brum, R. B. C., et al. 63
Vol. 5, N.1: pp. 63-70, February, 2014 ISSN: 2179-4804
Journal of Biotechnology and Biodiversity
Rúbia Borges Cruz Sarmento-Brum1, Henrique Guilhon de Castro2, Mônica Lau Silva3 , Renato Almeida Sarmento2, Ildon Rodrigues do Nascimento2, Gil Rodrigues dos Santos2 *
Effect of plant oils in inhibiting the mycelial growth of pathogenic fungi
ABSTRACT
The use of vegetable compounds as an alternative for control phytopathogens has received prominence in research to enable sustainable management methods in agriculture. Fungi such as Didymella bryoniae, Pyricularia grisea, Rhizoctonia solani, and Sclerotium rolfsii are important for causing great losses in production. In this context, the purpose was to evaluate the fungitoxicity of plant oils in inhibiting the mycelial growth of pathogenic fungi. The tests were conducted in completely randomized design with 13 treatments (Cymbopogon nardus, C. citratus, Lippia alba, Eugenia dysenterica, Caryocar brasiliense, Azadirachta indica, A. indica – commercial – Ageratum conyzoides, Jatropha curcas, Eucalyptus sp., Mentha piperita, Tiofanato metílico e Testemunha) and four
replications. To evaluate the fungitoxicity were distributed, 1.5 µL mL-1 of the treatment were distributed on the surface of PDA culture medium. The Eucalyptus sp., M. piperita, L. alba, C. nardus, and C. citratus essential oils inhibited the growth of the fungus P. grisea. D. bryoniae did not growth only in the treatment of C. citratus. The R. solani and S. rolfsii fungi did not show mycelial growth when subjected to treatments of M. piperita, L. alba, C. nardus, and C. citrates essential oils.
Key-words: Alternative control, essential oils, hydrolats.
Efeito de óleos vegetais na inibição do crescimento micelial de fungos fitopatogênicos
RESUMO
O uso de compostos vegetais como alternativa para controle de fitopatógenos tem recebido destaque em pesquisas que visam viabilizar métodos de manejo sustentável na agricultura. Fungos como Didymella bryoniae, Pyricularia grisea, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii são importantes por causarem grandes perdas na produção. Neste contexto, objetivou-se avaliar a fungitoxicidade de óleos vegetais na inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos. Os ensaios foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado com 13 tratamentos (Cymbopogon nardus, C. citratus, Lippia alba, Eugenia dysenterica, Caryocar brasiliense, Azadirachta indica, A. indica - comercial, Ageratum conyzoides, Jatropha curcas, Eucalyptus sp., Mentha piperita, Tiofanato metílico e Testemunha) e quatro repetições. Para a avaliação da fungitoxicidade, foram distribuídos 1,5µL mL-1 dos tratamentos na superfície do meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar). Os óleos essenciais de Eucalyptus sp., M. piperita, L. alba, C. nardus e C. citratus inibiram o crescimento de P. grisea. D. bryoniae não apresentou crescimento micelial apenas no óleo de C. citratus. Os fungos R. solani e S. rolfsii não cresceram quando submetidos aos tratamentos de óleos essenciais de M. piperita, L. alba, C. nardus e C. citratus .
Palavras-chave: Controle alternativo, óleos essenciais, hidrolatos.
*Autor para correspondência.
1Mestre em Produção Vegetal; Universidade Federal do Tocantins; 77402-970; Gurupi-TO - Brasil
2,*Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal; Universidade Federal do Tocantins; Gurupi - TO - Brasil, gilrsan@uft.edu.br;
3Professora; Instituto Federal Goiano; Ceres - GO - Brasil
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https://doi.org/10.20873/jbb.uft.cemaf.v5n1.brum
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INTRODUÇÃO Medice et al. (2007) observaram que os óleos de
Doenças fúngicas é um fator limitante para a eucalipto (Eucalyptus citriodora), nim
produção devido às perdas na produtividade e na qualidade de produtos agrícolas. Fungos fitopatogênicos como Didymella bryoniae , Pyricularia grisea, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii são importantes por causarem grandes perdas e prejuízos aos agricultores. O crestamento gomoso do caule, causado pelo fungo D. bryoniae, é uma doença importante para a cultura da melancia e está presente em todas as regiões produtoras de curcubitaceas do país (SANTOS et al., 2011). A brusone, tendo como agente causal P. grisea, é uma das doenças mais destrutivas do arroz e tem ocorrência generalizada em todas as regiões orizícolas do mundo (SILVA et al., 2009b). R. solani é um fungo habitante do solo que infecta diversos tipos de plantas em todo o mundo, e é responsável por até 50% de perdas na cultura de feijão-caupi em vários estados brasileiros (SARTORATO et al. 2006). O fitopatógeno S. rolfsii, causador da podridão do colo, apresenta extensa gama de hospedeiros, cerca de 500 espécies botânicas (MAFIA et al., 2007; SERRA e SILVA, 2005).
Ao longo das últimas décadas, as tentativas de controlar doenças de plantas são realizadas com uso de fungicidas sintéticos, por meio da erradição ou prevenção. Porém, seu uso contínuo interfere no controle biológico natural, leva ao desenvolvimento de resistência dos patógenos a vários tipos de fungicidas e ocasiona problemas ambientais (SOUYLU et al., 2010). Assim, novas alternativas de controle estão sendo buscadas, e o uso de produtos naturais, entre os quais os óleos essenciais, apresenta potencial para o manejo sustentável de doenças de plantas.
Scapin et al. (2010), constataram efeitos
(Azadirachta indica) e citronela ( Cymbopogon nardus) tiveram efeito direto na germinação dos urediniósporos de Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asiática da soja. Combrinck et al. (2011) avaliaram o efeito do óleo de pinhão- manso (Jatropha curcas) sobre os fungos Lasiodiplodia theobromae, Colletotrichum gloeosporioides, Alternaria citrii, Botrytis cinerea e Penicillium digitatum e observaram total inibição do crescimento dos patógenos. Considerando que as pesquisas de controle de doenças fúngicas por meio do uso de óleos essenciais tem aumentado consideravelmente nos últimos anos (DINIZ et al., 2008), e que a exploração da atividade biológica de compostos secundários presentes em diferentes extratos de plantas pode constituir uma forma efetiva de controle de doenças em plantas cultivadas, objetivou-se avaliar, in vitro, a fungitoxicidade de óleos vegetais na inibição do crescimento de D. bryoniae, P. grisea, R. solani e S. rolfsii .
MATERIAL E MÉTODOS
Os fungos fitopatogênicos P. grisea, D. bryoniae , R. solani e S. rolfsii foram multiplicados a partir de culturas armazenadas da Coleção Micológica do Laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal do Tocantins. Estes isolados foram obtidos em 2011, a partir de plantas hospedeiras (arroz, melancia, feijão caupi e feijão-comum, respectivamente) doentes.
Para a multiplicação dos fitopatógenos foram utilizadas placas de Petri de 90 x 15 mm com meio de cultura BDA (batata, dextrose e ágar). Utilizou-se, para cada fitopatógeno, um delineamento inteiramente casualizado com 13
fungitóxicos (fungicida/fungistático) em tratamentos, sendo 11 plantas (Tab.1), uma
experimentos realizados in vitro, utilizando-se óleo essencial de capim-limão ( Cymbopogon citratus) .
testemunha e um controle negativo. Para cada tratamento foram realizadas quatro repetições.
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Tabela 1. Plantas utilizadas para avaliação in vitro de fungitoxicidade sobre os fungos Didymella bryoniae, Pyricularia grisea, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfssi .
Tratamento Tipo Dose (µL.mL-1 )
Ageratum conyzoides (Mentrasto) Hidrolato 1,5
Azadirachta indica (Nim) Hidrolato 1,5
Azadirachta indica (Nim) Óleo comercial (NEEMAX®) 1,5
Caryocar brasiliense (Pequi) Hidrolato 1,5
Cymbopogon citratus (Capim-limão) Óleo essencial 1,5
Cymbopogon nardus (Citronela) Óleo essencial 1,5
Eucalyptus sp. (Eucalipto) Óleo essencial 1,5
Eugenia dysenterica (Cagaita) Óleo essencial 1,5
Jatropha curcas (Pinhão-manso) Hidrolato 1,5
Lippia alba (Erva-cidreira) Óleo essencial 1,5
Mentha piperita (Hortelã-pimenta) Óleo essencial 1,5
Para a obtenção dos óleos essenciais e hidrolatos, folhas das plantas foram desidratadas à temperatura ambiente. A extração foi realizada pelo método de hidrodestilação (CASTRO et al., 2010), utilizando o aparelho de Clevenger. Os sobrenadantes foram coletados e armazenados em frascos estéreis. Os óleos essenciais de hortelã-
pimenta (DOKMOS - Cosméticos®) e de eucalipto, e o óleo comercial de nim (NEEMAX® )
foram adquiridos no Mercado Municipal de Gurupi, TO.
Foram utilizadas placas de Petri contendo 20 mL de meio de cultura BDA. Para verificar o efeito dos óleos essenciais e hidrolatos sobre o crescimento micelial dos fitopatógenos foram utilizados 1,5 µL dos tratamentos das plantas por mL do meio de cultura. No tratamento testemunha não foi adicionado nenhum produto ao meio de cultura. Como controle negativo foi utilizado Tiofanato metílico (1000 ppm), um fungicida de largo espectro.Os tratamentos foram distribuídos na superfície do meio de cultura com auxílio de uma alça de Drigalsky. Após a distribuição, um disco de 6 mm de diâmetro de BDA contendo micélio do fungo foi colocado no centro das placas. As placas com os tratamentos e com as testemunhas foram vedadas com filme plástico PVC, identificadas e colocadas em sala de incubação à temperatura de 27 ºC.
No caso dos fitopatógenos que apresentaram crescimento lento, tais como D. bryoniae e P. grisea, foram realizadas cinco avaliações por medições do diâmetro micelial por meio de paquímetro digital, (média de duas medidas diametralmente opostas) a cada 48 horas, a partir da instalação do experimento (dois, quatro, seis, oito e dez dias de incubação).
Já para os fungos que apresentaram crescimento rápido, R. solani e S. rolfsii, foi realizada apenas uma avaliação, por medição do diâmetro micelial (média de duas medidas diametralmente opostas), após quatro dias de incubação, dia em que o fungo do tratamento testemunha cobriu toda a superfície do meio de cultura.
Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e regressão. No fator qualitativo, as médias foram comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade, e no fator quantitativo foram ajustadas equações de regressão com base no teste “t” dos coeficientes e no coeficiente de determinação (r²). As análises foram realizadas por meio do sistema computacional SAEG (RIBEIRO JÚNIOR e MELO 2008).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os hidrolatos utilizados nesse trabalho não apresentaram ação fungitóxica significativa para nenhum dos fitopatógenos avaliados. Franzener et al. (2007) avaliaram ação de diferentes concentrações de hidrolatos de canela-de-veado (Helietta apiculata), citronela (C. nardus) e buva (Conyza canadensis) sobre o fungo Alternaria brassicae, e observaram que nenhum dos tratamentos inibiram o crescimento micelial do patógeno. Assim, é possível que os compostos antifúngicos sintetizados por essas plantas se concentrem no óleo essencial, e se encontrem em pequenas quantidades no hidrolato.
O único tratamento em que o fungo D. bryoniae não apresentou crescimento micelial foi o óleo essencial de capim-limão. Diferentes estudos confirmam os resultados apresentados nesse trabalho, mostrando a ação positiva no controle in vitro de fitopatógenos pelo óleo essencial de
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capim-limão. Fiori et al. (2000) observaram a inibição do crescimento micelial de D. bryoniae quando submetido a tratamentos de 20µL do óleo essencial de capim-limão distribuídos na superfície do meio de cultura BDA. Concentração de 1µL.mL-1 desse óleo inibiu totalmente o crescimento micelial do fungo Colletotrichum gloeosporioides (SOUZA JÚNIOR et al., 2009).
Quando submetido ao hidrolato de nim, D. bryoniae apresentou maior diâmetro micelial em todas as avaliações (Tab.2). Venturoso et al. (2011), corroborando com observado neste experimento, destacou que o óleo de nim favoreceu o crescimento de Fusarium solani .
Tabela 2. Crescimento micelial (mm) de Didymella bryoniae submetido a óleos essenciais e hidrolatos de plantas em cinco épocas de avaliação (2, 4, 6, 8 e 10 dias de incubação).
Tratamentos
2
Épocas de avaliação (dias de incubação)
4 6 8 10
Equação de Regressão
R 2
Testemunha 15,72 ab 39,92 cd 61,97 b 82,86 a 84,00 a ŷ=3,05+8,97 EA** 0,94
Tiofanato metílico 23,75 a 51,59 ab 67,74 ab 78,03 ab 80,18 a ŷ=18,46+6,97 A** Nim1 24,08 a 53,87 a 76,31 a 84,00 a 84,00 a ŷ=19,46+7,50 EA**
0,83 0,85
Mentrasto 1
Pinhão-manso 1
17,98 ab 42,82 bc 64,00 b 78,01 ab 80,28 a ŷ=8,68+7,99 EA** 15,60 ab 40,04 cd 63,74 b 83,41 a 84,00 a ŷ=3,31+9,01 EA**
0,84 0,93
Pequi1 14,52 ab 38,18 cd 61,28 b 84,00 a 84,00 a ŷ=0,97+9,02 EA** 0,94
Nim comercial Cagaita 2
7,38b cd 20,71 ef 34,41 d 49,38 c 64,67 b ŷ=-7,66+7,16 EA** 11,81 bc 31,53 de 49,77 c 70,11 b 81,39 a ŷ=-4,40+8,89 EA**
0,99 0,94
Eucalipto 2
Hortelã-pimenta 2
3,62 cd 14,87 f 25,34 d 35,22 d 46,21 c ŷ=-6,61+5,28 EA** 0,99 0,00 d 0,00 g 2,15 e 5,12 e 19,42 d ŷ=8,58-5,03 EA*+0,60 EA** 0,61
Erva-cidreira2 0,00 d 0,00 g 0,84 e 6,60 e 17,93 d ŷ=-7,66+2,12 EA** 0,66
Citronela2 0,00 d 0,00 g 0,00 e 9,78 e 22,36 d ŷ=-9,49+2,73 EA** 0,60
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
1Hidrolato. 2Óleo essencial. **Significativo a 1% de probabilidade pelo teste “t”. *Significativo a 5% de probabilidade pelo teste “t”.
Para o fungo D. bryoniae, o controle negativo com Tiofanato metílico mostrou diferença significativa da testemunha apenas na segunda época de avaliação, sendo que o diâmetro micelial submetido ao fungicida foi maior do que o da testemunha. Santos et al. (2006) testaram diferentes doses do fungicida sobre este fungo, e destacaram que todos os isolados avaliados foram resistentes a todas as doses testadas.
Por meio da equação de regressão, observou-se que os óleos essenciais de hortelã-pimenta, erva- cidreira e citronela reduziram significativamente o crescimento diário do D. bryoniae, o que levou um menor desenvolvimento no estágio final. O menor crescimento micelial do patógeno foi de 2,12 mm dia-1, quando submetido ao tratamento de erva- cidreira. Em contraste, na testemunha, o fungo
cresceu em média 8,97 mm dia-1. Em estudos realizados por Veloso et al. (2012) verificou-se que o óleo essencial do capim citronela apresentou efeito de inibição sobre os fungos fitopatogênicos Amphobotrys ricini, Didymella bryoniae e Colletotrichum gloeosporioides .
Combrinck et al. (2011), avaliando o efeito do óleo de hortelã-pimenta, observaram inibição completa do crescimento micelial de Penicillium digitatum. Anaruma et al. (2010) observaram total inibição do crescimento micelial do fungo C. gloeosporioides, quando utilizaram óleo essencial de erva-cidreira.
Os tratamentos com os óleos essenciais de eucalipto, hortelã-pimenta, erva-cidreira, citronela e capim-limão apresentaram uma ação mais positiva no controle de P. grisea do que para D. bryoniae, uma vez que inibiram totalmente o crescimento micelial do patógeno. A ação antifúngica desses óleos essenciais são confirmadas em diferentes estudos. Carnelossi et al. (2009) observaram total inibição do desenvolvimento do fungo Colletotrichum gloeosporioides pela ação do óleo essencial de capim-limão. Pereira et al. (2011) verificaram ação fungitóxica do óleo de citronela sobre a germinação e alongamento dos tubos germinativos do patógeno Cercospora coffeicola .
Combrinck et al. (2011) observaram efeito fungitóxico do óleo essencial de hortelã-pimenta
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sobre C. gloeosporioides. Tyagi e Malik (2011) avaliando o óleo essencial de eucalipto sobre fungos que causam deterioração de alimentos, observaram ação fungitóxica significativa do óleo sobre o desenvolvimento dos patógenos.
Quando submetido ao fungicida, após quatro dias de incubação, o diâmetro micelial de P. grisea foi
significativamente menor do que o da testemunha (Tabela 3). Oliveira et al. (2001) destacaram que o tiofanato metílico isoladamente ou em mistura, tanto em testes de laboratório quanto em testes de campo, reduzem o crescimento micelial de P. grisea e os níveis de infecção pelo patógeno nas plantas do arroz.
Tabela 3. Crescimento micelial (mm) de Pyricularia grisea submetido a óleos essenciais e hidrolatos de plantas em cinco épocas avaliação (2, 4, 6, 8 e 10 dias de incubação).
Tratamentos
2
Épocas de avaliação (dias de incubação) 4 6 8 10
Equação de Regressão
R 2
Testemunha 5,95 ab 20,92 ab 34,77 a 48,74 a 63,79 a ŷ=-8,22+7,17 EA** 0,99
Tiofanato metílico 4,87 ab 15,75 bc 26,78 b 33,74 b 53,77 b ŷ=-7,76+5,79 EA**
Nim1 7,15 a 22,23 ab 35,91 a 50,03 a 64,24 a ŷ=-6,68+7,10 EA** Mentrasto1 7,29 a 22,68 a 37,18 a 51,59 a 65,05 a ŷ=-6,57+7,22 EA**
0,86 0,99 0,99
Pinhão-manso 1
Pequi 1
7,05 a 22,29 ab 36,41 a 50,25 a 63,71 a ŷ=-6,44+7,06 EA** 5,65 ab 20,88 ab 35,02 a 49,68 a 64,68 a ŷ=-8,88+7,34 EA**
0,99 0,99
Nim comercial Cagaita 2
1,44 ab 9,83 cd 20,54 bc 32,14 b 45,56 c ŷ=-11,27+5,53 EA** 0 b 8,89 d 17,99 c 28,53 b 39,12 c ŷ=-10,46+4,89 EA**
0,98 0,95
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
1Hidrolato. 2Óleo essencial. **Significativo a 1% de probabilidade pelo teste “t”.
Os tratamentos de óleo essencial de cagaita e nim comercial apresentaram melhor efeito fungitóxico para P. grisea quando comparados aos tratamentos que não inibiram totalmente o crescimento micelial do fungo (Tab. 3). Muitos trabalhos mostram o efeito antimicrobiano de óleos essenciais de cagaita. Costa et al. (2000), utilizando o óleo extraído das folhas de cagaita, observaram efeito fungitóxico contra os dermatófitos Cryptococcus neoformans var. neoformans e C. neoformans var. gatti.
Na quinta avaliação, foi observado que o tratamento do óleo de nim comercial reduziu o crescimento micelial de P. grisea em 30%. Triana e González (2009), avaliando diferentes concentrações de óleo de nim sobre P. grisea , observaram uma inibição de 40% do crescimento micelial do fungo, o que corrobora com este resultado.
Sob os tratamentos testemunha e hidrolatos de
nim, mentrasto, pinhão-manso e pequi, o fitopatógeno cresceu em média 7 mm dia-1 (Tab.
3). O menor crescimento micelial diário (4,89 mm dia-1) foi quando submetido ao óleo essencial de
cagaita.
A resposta do crescimento micelial de R. solani e S. rolfsii sob os diferentes tratamentos foi semelhante para os dois fungos. Observou-se em todas as avaliações que os óleos essenciais de hortelã-pimenta, erva-cidreira, citronela e capim-
limão inibiram totalmente o crescimento dos fitopatógenos. Tagami et al. (2009) testaram a fungitoxidade de extratos de erva-cidreira no desenvolvimento dos fungos R. solani e S. rolfsii e destacaram baixas taxas de inibição do crescimento. No atual estudo, como foi utilizado óleo essencial, a fungitoxidade foi maior, apresentando inibição de 100% do crescimento micelial para esses patógenos.
Triana e González (2009), avaliando o efeito do óleo de nim sobre R. solani, observaram redução no crescimento micelial do patógeno. Esses autores destacaram que o óleo de nim apresentou uma porcentagem de inibição de 56% para R. solani. Esse resultado diferiu do que foi encontrado neste estudo, onde a porcentagem de inibição para o mesmo patógeno foi igual à zero (Fig.1).
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Figura 1 - Diâmetro micelial médio de Rhizoctonia solani submetido a óleos essenciais e hidrolatos de plantas após quatro dias de incubação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Hidrolato (H); Óleo essencial (OE).
Não houve diferença significativa entre a testemunha e os tratamentos de hidrolatos (nim, mentrasto, pinhão-manso e pequi), Tiofanato
metílico e óleo comercial de nim (NEENMAX® )
tanto para R. solani quanto para S. rolfsii (Fig. 2). Silva et al. (2009a) avaliando o efeito do hidrolato e do óleo essencial de capim-limão sobre o crescimento do fungo C. gloeosporioides observaram que o óleo inibiu totalmente o desenvolvimento do patógeno e o hidrolato não diferiu da testemunha.
Figura 2 - Diâmetro micelial médio de Sclerotium rolfsii submetido a óleos essenciais e hidrolatos de plantas após quatro dias de incubação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade. Hidrolato (H); Óleo essencial (OE).
O tratamento óleo essencial de cagaita reduziu o crescimento micelial do fungo R. solani em 43% e do fungo S. rolfsii em 30%. O óleo de eucalipto apresentou maior efeito fungitóxico que o óleo de cagaita, uma vez que reduziu o crescimento micelial do R. solani em 84% e do S. rolfsii em 77%. Souza et al. (2002), relataram o potencial da atividade antifúngica de diferentes plantas do Cerrado, destacando o uso de extratos e compostos bioativos da cagaita.
Estudos mostram a ação de outros óleos essenciais sobre R. solani e S. rolfsii: Benini et al. (2010), testaram alíquotas do óleo essencial de Ocimum gratissimum e verificaram que todas as doses inibiram totalmente o crescimento dos fungos. Derbalah et al. (2011) avaliaram o efeito de diferentes extratos de plantas sobre o crescimento micelial de S. rolfsii, e destacaram a inibição de 82,8% do crescimento do fungo quando submetido ao extrato da planta pau-de-rosa ( Thespesia populnea var. acuteloba ).
Os óleos essencias de plantas são fontes potenciais de compostos antimicrobianos. Muitas vezes, é difícil comparar resultados obtidos em diferentes estudos, pois a composição dos óleos pode variar, dependendo da região geográfica, a variedade e idade da planta, o método de secagem e o método de extração do óleo (AL-REZA et al., 2010).
CONCLUSÕES
O óleo essencial de capim-limão (C. citratus ) inibiu o desenvolvimento dos fungos D. bryoniae , P. grisea, R. solani e S. rolfsii, apresentando alto potencial para o controle alternativo desses fitopatógenos. Os óleos essenciais de hortelã- pimenta (M. piperita), erva-cidreira (L. alba) e citronela (C. nardus) também apresentam potencial como alternativa aos fungicidas sintéticos aplicados para o controle de P. grisea, R. solani e S. rolfsii .
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Recebido: 02/07/2013 Received: 07/02/2013
Aprovado: 26/10/2013 Approved: 10/26/2013
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