Oliveira, E. M. et al. 290

Vol. 4, N.4: pp. 290-298, November, 2013 ISSN: 2179-4804

Journal of Biotechnology and Biodiversity

Genetic divergence among mentrasto accessions based on RAPD markers at Tocantins State

Elainy Martins Oliveira1,*, Waldesse Oliveira Junior2, Jaqueline Oliveira2, Henrique Guilhon de Castro 3

ABSTRACT

Ageratum conyzoides (Asteraceae) is known in Brazil for its medicinal properties being mainly used as painkiller and anti-inflammatory. Due to the existence of few genetic studies for this species, this work aimed to characterize the genetic diversity among nine accessions from different sites at Tocantins state, to provide information about its genetic resources. Similarity coefficients obtained varied from 48% to 80%, result of amplification of 102 fragments, of which 72 (70.5%) were polymorphic. Groupment analysis allowed the differentiation in three groups. One of them was distinguished because it presented the highest similarity among all, being composed by ANA and NAT (80% similarity). In general, these data showed there is low degree of association between the geographic location of the accessions and the genetic distances. So, the collected accession ns in Tocantins state presented considerable genetic variability and the efficiency of RAPD markers for such characterization was here proven.

Key-words: Ageratum conyzoides, genetic variability, medicinal plants.

Divergência genética entre acessos de mentrasto do Estado do Tocantins através de marcadores RAPD

RESUMO

O mentrasto, Ageratum conyzoides (Asteraceae), é conhecido no Brasil por suas propriedades medicinais, sendo usado principalmente como analgésico e anti-inflamatório. Como existem poucos estudos genéticos dessa espécie, este trabalho buscou caracterizar a diversidade genética, com base em marcadores RAPD, entre nove acessos provenientes de diferentes municípios do Tocantins, para fornecer informações sobre seus recursos genéticos. Os coeficientes de similaridades obtidos variaram de 48 a 80%, considerando a análise de 102 fragmentos dentre os quais 72 (70.5%) foram polimórficos. A análise de agrupamento permitiu a diferenciação de três grupos. O grupo com maior similaridade genética (80%) foi composto pelos acessos ANA e NAT. No geral, os dados mostraram haver pouca relação entre a origem geográfica dos acessos e o padrão de divergência genética obtido. Assim, os acessos coletados no Tocantins apresentaram considerável variabilidade genética e os marcadores RAPD foram adequados para esta caracterização. .

Palavras-chave: Ageratum conyzoides, variabilidade genética, plantas medicinais.

*Autor para correspondência.

1Departamento de Ciências Exatas e Biotecnológicas; Universidade Federal do Tocantins; 77402-970; Gurupi - TO – Brasil. biocris@uft.edu.br

2Laboratório de Biotecnologia, Universidade Federal do Tocantins; 77001-090; Palmas - TO – Brasil.

3Departamento de Ciências Agrárias e Tecnológicas; Universidade Federal do Tocantins; 77402-970; Gurupi - TO - Brasil .

J. Biotec. Biodivers. v. 4, N.4: pp. 290-298, Nov, 2013

https://doi.org/10.20873/jbb.uft.cemaf.v4n4.oliveira

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INTRODUÇÃO

A ampla diversidade em populações naturais de

plantas disponibiliza grande potencial de genes e alelos de interesse em programas de melhoramento genéticos. Nesse contexto, a conservação de

plantas medicinais é uma estratégia fundamental para garantir a manutenção de sua variabilidade

genética, possibilitando futuros trabalhos de bioprospecção gênica e de m etabólitos secundários, produtos de interesse obtidos destas.

A flora medicinal brasileira é riquíssima, com inúmeras espécies utilizadas na medicina popular, porém a grande maioria destas espécies requer

estudos básicos que viabilizem sua conservação (Melo et al.,2009) .

A diversidade genética em plantas pode ser determinada por meio de características morfológicas e agronômicas, isoenzimas e análises de marcadores moleculares (Liu, 1997; Xuet al., 2003). Neste cenário, os progressos da biologia

molecular vêm proporcionando o desenvolvimento

de ferramentas de grande eficiência para as estratégias de conservação in situ e ex situ, bem como a caracterização da diversidade existente

(Santos et al.,2011) .

Marcadores moleculares permitem acessar a variabilidade genética ao nível de DNA das

plantas. Existem diferentes técnicas que permitem identificar diretamente o polimorfismo de DNA e,

portanto, marcar sequencias ou partes específicas do mesmo. Com marcadores moleculares é

possível ter para cada gene de grande efeito um ou

mais marcadores que podem ser utilizados para a identificação do fenótipo desejado (Milach, 1998 ).

Marcadores como RAPD, Microssatélite e AFLP (polimorfismo de comprimento de fragmentos

amplificados) são alguns dos mais utilizados em estudos genéticos (Ferreira e Grattapaglia, 1998 ).

Os marcadores RAPD permitem distinguir

genótipos de forma eficaz, uma vez que facilitam a identificação de casos de sinonímias e homonímias entre cultivares; e auxiliam na seleção dos

indivíduos que poderão ser utilizados para compor bancos de germoplasma ou serem utilizados no

melhoramento genético (Paula et al., 2012) .

Os marcadores baseados em PCR ( Polimerase

Chain Reaction), como o RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA), têm sido usados

com sucesso na análise de distância genética em

várias espécies de plantas (Lin et al., 2009; Santos et al., 2011; Oliveira et al., 2012), mostrando se r

eficiente na caracterização da variação genética

entre organismos próximos, dentro e entre espécies de uma população .

A técnica de RAPD também se mostra como uma ferramenta útil para a análise da diversidade

genética molecular em populações naturais de plantas (Silveira et al.,2009).Essa técnica

distingue-se das demais pelo fato de utilizar primers com 10 pares de bases de extensão, cuja

sequência nucleotídica é arbitrária, ao contrário

das outras que requerem informações a respeito da seqüência do DNA alvo para o desenho de primers

específicos (Williams et al., 1990). Dentre as diversas técnicas utilizadas, RAPD é a de menor

custo,número de etapas e tempo para obter os resultados,além de fácil execução. Contudo,

apresenta a desvantagem de ser de baixa

repetibilidade e pouca consistência de um laboratório para o outro, o que dificulta a comparação de dados obtidos em diferentes locais

(Milach, 1998). Em geral, como não é necessário conhecimento prévio sobre o genoma da espécie

avaliada e os primers utilizados são aleatórios, uma série de reações costumam ser realizadas (cada reação um primer) para se avaliar polimorfismo através de RAPD. No entanto, alguns trabalhos têm sugerido que quando a variabilidade genética é elevada em uma

população, o uso de poucos primers, ou um menor número de reações seriam suficientes (Millan et al., 1996; Li et al.,1999), o que reduziria custo e

tempo operacional.Vale ressaltar que para o mentrasto, praticamente não há trabalhos de análise genética e deste modo, é interessante iniciar o estudo da espécie com marcadores de

baixo custo e com rápidos resultados, verificando se há ou não variação genética na espécie.

O mentrasto (Ageratumconyzoides L.) é uma planta herbácea anual pertencente à família

Asteraceae, sendo conhecida popularmente como erva-de-são-joão, picão-roxo ou mentrasto (Millani et al., 2010). É uma planta nativa da

América tropical com adaptação a diversas condições ambientais, estabelecendo-se em várias

regiões de clima tropical e subtropical do mundo. Nos países onde ocorre, pode ser encontrada desde

o nível do mar até 3000 metros de altitude, quando

a temperatura está acima de 10ºC (Castroet al. , 2008).

A. conyzoides, possui uso medicinal difundido pela população no Brasil e em outros países. A sua

ampla utilização deve-se à inclusão na lista da Central de Medicamentos, sendo preconizada pelo

Ministério da Saúde, como medicamento

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antirreumático. O óleo essencial de mentrasto é conhecido no Brasil e em outros países da América devido suas propriedades como

analgésico, anti-inflamatório e cicatrizante, sendo

empregado como fitoterápico (Soares et al., 2011). Entretanto, pouco se conhece sobre a

biodiversidade genética dessa espécie. Além disso, por causa da intensa utilização pela população de

baixa renda e das múltiplas utilidades atribuídas ao

mentrasto, esforços para analisar a diversidade genética dessa espécie têm importância cientifica,

prática e econômica.

Um estudo da divergência genética entre acessos

de mentrasto foi recentemente realizado no Estado do Tocantins, mostrandodivergência entre tais

acessos, avaliados através de caracteres

morfológicos(Castro et al., 2011). No entanto, são escassos os trabalhos envolvendo marcadores moleculares na caracterização da diversidade

genetica dessa espécie (Soares et al., 2011; Millani et al., 2010; Castro el al., 2008; Castro et al., 2006;

Castro et al., 2004a; Castro el al., 2004b). No presente trabalho foram estudados os acessos tambémavaliados por Castro et al. 2011.

Este estudo teve por objetivo caracterizar a diversidade genética com base em marcadores

moleculares do tipo RAPD, entre acessos de mentrasto coletados em diferentes cidades no Estado do Tocantins. Assim, o trabalho procurou

agregar informações básicas para futuros

programas de melhoramento e obtenção de um panorama que subsidie melhores estratégias de

manejo dessa planta medicinal. MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal

Nove acessos de mentrasto foram comparados

usando marcadores RAPD. Os acessos foram provenientes de cinco diferentes regiões cli máticas

do Estado do Tocantins, segundo o método de Thornthwaite & Mather (1955). Assim, a coleta das sementes foi realizada em plantas individuais, tomadas ao acaso em vários municípios e como out group foi utilizado um exemplar da cultivar BD#115 de batata-doce do Banco de

Germoplasma da UFT (Tabela 1). Em cada área

foram coletadas sementes de 15 plantas e, posteriormente, retirada a mesma quantidade de sementes por planta para a formação do bulk e a

implantação do experimento.

Tabela 1. Relação dos municípios onde foram realizadas as coletas dos acessos (Ageratum conyzoides ) estudados e seus respectivos códigos.

Identificação Origem Código Latitude e longitude Clima*

01 Formoso FOR 11º47’S, 49º32’W B2rA'a'

02 Gurupi GUR 11º43’S, 49º03’W B1wA'a'

03 Aliança ALI 11º18’S, 48º56’W B1wA'a'

04 Ananás ANA 06º22’S, 48º05’W C2rA'a'

05 Natividade NAT 11º37’S, 47º45’W C2wA'a'

06 Arraias ARR 12º55’S, 46º57’W C1dA'a'

07 Novo Alegre NOV 12º55’S, 46º34’W C1dA'a'

08 Taguatinga TAG 12º24’S, 46º21’W C1dA'a'

09 Combinado COM 12º47’S, 46º32’W C1dA'a'

10 --- BD#115 ---

* B2rA'a' - clima úmido, com pequena ou nula deficiência hídrica; B1wA'a' - clima úmido, com moderada deficiência hídrica; C2rA'a' - clima úmido subúmido, com pequena deficiência hídrica; C2wA'a' - clima úmido subúmido, com moderada deficiência hídrica; C1dA'a' - clima subúmido seco, com moderada deficiência hídrica.

O cultivo dos acessos foi realizado durante os

meses de Outubro a Dezembro de 2005 em casa de vegetação, na área experimental da Universidade

Federal do Tocantins – UFT, campus universitário de Palmas, localizado a uma latitude de 10º20’S e longitude de 48º35’W, em clima úmido com

temperatura média de 27ºC. A produção de mudas

para a propagação dos acessos foi realizada por

sementes em bandejas de isopor, preenchidas com substrato comercial à base de vermiculita e carvão

vegetal. As mesmas foram transplantadas para a unidade experimental 50 dias após a semeadura, onde se utilizou um vaso de seis litros com três

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plantas, e uma mistura de terra e substrato comercial.

Extração e amplificações de DNA

O DNA foi extraído a partir de 50 mg de folhas

jovens tomadas ao acaso, de três indivíduos de cada acesso, utilizando o método de extração

CTAB, conforme o protocolo descrito por Ferreira e Grattapaglia (1998), com modificações. Após a extração, a quantidade, a integridade e a pureza do

DNA foram estimadas por espec trofotometria

(Modelo Ultrospec 1000, GE – HEALTHCARE, USA) e por eletroforese em gel de agarose 1%. As concentrações foram ajustadas para 20 ng/µL, que

foi a concentração final da solução de trabalho.

A seleção dos primers foi realizada de acordo com aqueles que produziram um bom padrão de

detecção e o maior número de fragmentos amplificados. No total, foram testados 30 primers

(Operon Technologies, Alameda, CA), sendo

selecionados 11 primers mais informativos quanto ao numero de alelos.

Tabela 2. Sequência dosprimersarbitrários usados para as reações de RAPD.

Primers Sequência nucleotídica Nf Np

OPC – 18 5'-TGAGTGGGTG-3' 12 6

OPK – 11 5'-AATGCCCCAG-3' 12 11

OPL – 01 5'-GGCATGACCT-3' 8 7

OPM – 04 5'-GGCGGTTGTC-3' 6 5

OPM – 10 5'-TCTGGCGCAC-3' 12 9

OPM – 20 5'-AGGTCTTGGG-3' 12 7

OPN – 18 5'-GGTGAGGTCA-3' 5 4

OPT – 08 5'-AACGGCGACA-3' 11 9

OPT – 16 5'-GGTGAACGCT-3' 4 2

OPY – 17 5'-GACGTGGTGA-3' 10 8

OPY – 19 5'-TGAGGGTCCC-3’ 10 4

Nf: número de fragmentos; Np: número de fragmentos polimórficos.

As reações de PCR foram realizadas em termociclador modelo PxE Thermal Cycler (Thermo Electron Coporation), com um volume

final de 15 µL, com 9,25 µL de água destilada, 2,5 mM de MgCl2, 0,2mM de dNTPs, 1X tampão da Taq polimerase (100 mM Tris-HCl, 500 mM de

KCl), 10 pmoles de primer, 1U de Taq DNA Polimerase (LCG do Brasil, Rio de Janeiro RJ); e

40 ng de DNA. As condições de PCR foram: 94ºC

por 40s, 35ºC por 1min, 72ºC por 2min; sen do estas três etapas repetidas três vezes, seguidas por

mais 37 ciclos de 94ºC por 40s, 37ºC por 40s, 72ºC por 2min. Adicionalmente, houve a extensão

final de 72ºC por 5 min e incubação de 4ºC por 10min como etapa final.

Análise dos dados

Os produtos de amplificação foram submetidos à

eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio (10mg/mL), tampão de 0,5x,

fonte a 80W com 1h de corrida. A visualização foi

feita em transluminador UV modelo LTA 20x20 (Loccus Biotecnologia), e fotografados para as análises. Os marcadores RAPD gerados foram

convertidos em uma matriz de dados binários, a

partir da qual foi calculada a similaridade genética pelo índice definido por Jaccard :

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D ij



a 

a

b  c


01 02 0304 05 06 07 08 09 10 B M

sendo: a = número de casos em que ocorre a presença da banda em ambos os indivíduos,

simultaneamente; b = número de casos em que

ocorre a presença da banda somente no individuo X; c = número de casos em que ocorre a presença da banda somente no indivíduo Y.A partir desses

índices, foi construído um dendograma, pelo

método do UPGMA. Tais análises foram desenvolvidas por meio do software PAST, versão

1.44.

Estimativas de distâncias geográficas entre locais de coleta de 13 acessos foram calculadas de

acordo com Steiner e Garcia de Los Santos (2001),

utilizando-se as informações de latitude e longitude disponíveis (Tabela 1).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos 30 primers testados, 11 foram selecionados

pelo padrão de amplificação, sendo que todos apresentaram fragmentos polimórficos. Um total de 102 fragmentos foi gerado, com uma média de

9,27 por primer (Tabela 2). Castro et al. (2004)

trabalhando com mentrasto, utilizaram 14 primers e obtiveram 26 bandas polimórficas, com média de

1,86 banda por primer, onde o número de bandas polimórficas variou de um a quatro por prime r utilizado. Isso mostra que a média encontrada no

presente trabalho foi maior.

Dentre os fragmentos de RAPD, 72 (70,5%) foram

polimórficos, variando de dois (OPT-16) a 11 (OPK-11) fragmentos amplificados por primer, os quais foram utilizados na caracterização d a

variabilidade genética. A figura 1 mostra alguns dos marcadores gerados por um dos iniciadores

selecionados. As similaridades genéticas obtidas entre os nove acessos de mentrasto, relativas aos 102 loci, variaram de 48 a 80%. Tais valores foram obtidos entre os acessos GUR e ARR e entre ANA e NAT, respectivamente.

Figura 1 -Perfil eletroforético de um gel de RAPD utilizando o primer OPY-17 em 09 acessos de mentrasto, um de batata-doce (10), um controle (B) e na extremidade o padrão de peso molecular de 100 pb (M) .

Melo et al.(2009), avaliando a divergência

genética em Lychnophora ericoides Less. - Asteraceae, popularmente conhecida como arnica

e constituinte da mesma família do mentrasto , obteve um índice de dissimilaridade variando entre 62 a 71%. Os mesmos autores afirmaram que os resultados obtidos com a técnica RAPD demonstram a clara separação genética entre as populações de arnica.

Por meio do dendograma obtido, verificou-se a

separação dos acessos de mentrasto em 2 grupos principais, com ponto de corte a aproximadamente 65% (Fig. 2). Também houve a formação de um

grupo isolado, formado pela batata- doce,

apresentando a menor similaridade (17%) quando comparada aos diferentes acessos, como era

esperado. Outro grupo formado pelos acessos ARR e FOR apresentou similaridade genética de

65%. No terceiro grupo, composto por sete acessos e subdividido em dois grupos, o coeficiente de

similaridade variou de 63 a 80%, onde se destaca o

subgrupo constituído por cinco acessos (ANA, NAT, COM, NOV e TAG). Segundo Castro et al. (2011) os acessos ALI, GUR, COM e NOV

estiveram nos mesmos grupos, quando enfatizado

as similaridades entre esses acessos com base no uso de características morfológicas. Podemos

observar que os acessos COM e NOV se comportam de forma similar, tanto na avaliação molecular como na avaliação morfológica. Os

acessos ANA (06º22’S) e NAT (11º37’S)

mostraram a maior similaridade genética (80,51 %) em relação aos demais acessos de mentrasto.

Dessa forma, não houve relação entre os grupos de

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similaridade genética (Fig. 2) e as distâncias

geográficas (Tabela 3) .


Figura 2 -Dendograma feito a partir de nove acessos de mentrasto e um de batata- doce (BD#115), por meio do índice de similaridade de Jaccard e agrupamento UPGMA.

Tabela 3. Distâncias geográficas (em km) entre os locais de coleta de 09 acessos de Ageratum conyzoides .

Acesso FOR GUR ALI ANA NAT ARR NOV TAG COM

FOR -

GUR 98,68 -

ALI 76,2 69,06 -

ANA 191,74 175,8 135,65 -

NAT 125,29 111,54 69,87 158,41 -

ARR 275,55 250,58 185,71 276,53 166 -

NOV 290,83 264,93 196,69 292,46 173,77 223,96 -

TAG 288,81 263,12 194,09 294,08 171,88 220,11 217,09 -

COM 291,28 265,36 196,91 293,24 173,94 223,72 222 216,46 -

No trabalho de Castro et al. (2011), os autores

conseguiram formar vários grupos, de acordo com a época de colheita (Tabela 4). Na primeira

época de colheita, dois grupos foram formados , onde o par mais divergente foi formado pelos acessos NAT e ARR enquanto o par menos

divergente foi constituído pelos acessos ALI e TAG. Os acessos NAT e ARR também formaram o par mais divergente na segunda

época de colheita e o par menos divergente foi

constituído pelos acessos ANA e TAG. De forma diferente, na terceira época de colheita os

acessos ANA e TAG formaram o par mais divergente. Na quarta e ultima época de colheita avaliada o acesso TAG formou o par mais

divergente com o acesso FOR e o acesso GUR formou o par menos divergente com o acesso ALI.

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Tabela 4. Grupos de acessos similares de nove acessos de mentrasto (Ageratum conyzoides) estabelecidos por meio do método de Tocher, em quatro épocas de colheita.

Épocas de colheita

Grupos 21 Dat 42 Dat 63 Dat 84 Dat

ALI TAG GUR ALI TAG GUR ALI GUR NOV ALI TAG GUR

1 NOV FOR ANA NOV FOR ANA ARR COM e NAT NOV NAT ANA

ARR e COM e COM ARR e COM

2 NAT ARR FOR FOR

3 NAT ANA

4 TAG

Fonte: Castro et al., 2011.

DAT: Dias após transplante.

Ainda no trabalho de Castro et al. (2011) foi observada umavariação na constituição dosgrupos pelos acessos de acordo com o estádio de desenvolvimento no qual a divergência genética

foi estimada, e portanto, a divergência genética

entre acessos de mentrasto, avaliada por caracteres morfológicos, é influenciada pelo estádio de desenvolvimento da espécie e que, de uma forma

geral, os acessos coletados na mesma região climática formaram grupo juntos. Este fato mostra a importância da coleta de germoplasma de A.

conyzoides em diferentes regiões climáticas, com o

objetivo de obter maior representatividade da variabilidade genética existente.

Os acessos COM, NOV e TAG, que apresentaram similaridade genética, estão na mesma região climática, sugerindo que existe influência

climática na divergência genética (Tabela

1).Castro et al. (2011), verificou que a divergência genética estimada estava relacionada com um

determinado estágio de desenvolvimento. Assim, os acessos que formaram grupo nas quatro épocas

de colheita foram ALI, GUR, COM e NOV,

mostrando similaridade. Já no presente estudo, pela análise de marcadores RAPD, os acessos COM e NOV foram os únicos que também

apresentaram similaridade genética, sendo aqui agrupados com ANA, NAT e TAG. Quanto à

relação entre as divergências genéticas dos acessos e regiões climáticas, observou-se quede forma geral, acessos coletados na mesma região climática foram mais semelhantes. Apenas os acessos ARR, na segunda época de colheita, e TAG, na terceira época de colheita, formaram grupos separados dos

outros acessos coletados na mesma reg ião climática .

Castro et al. (2011) enfatizou as similaridades entre essesacessos com base no uso de características morfológicas. Os acessos que

revelaram menor proximidade genética, utilizando características morfológicas, foram NAT e FOR que não formaramgrupo juntos em nenhuma época de colheita .

Possivelmente, as circunstâncias ambientais sob as

quais os acessos foram coletados diferem consideravelmente entre os estudos. Assim, ligeiras diferenças genéticas entre eles podem

representar adaptações a diferentes condições (Gustineet al., 2002).

Outros trabalhos realizados em Curcumalonga , (Janet al., 2011) e em Bidens spp, (Vidal et al .,

2006), mostraram a eficácia do uso de marcadores RAPD na detecção da variabilidade genética. Castro et al.(2004), também estudando A .

conyzoides por RAPD confirmou a eficiência da

técnica. Os marcadoresmoleculares atuam como uma ferramenta eficiente na análiseda

variabilidade genética,identificando diferenças entre os materiais em nível deDNA. As técnicas

moleculares fornecem aos pesquisadoresuma nova fonte de informações, que utilizadas em

conjuntocom os dados morfológicos e

agronômicos acabamcontribuindo para o aumento da eficácia do programa (Faleiro, 2007).

De acordo com Melo et al. (2009) a alta variação

genéticaentre populações tem implicação direta para a proposta de conservação, indicando uma

coleta de sementes de grande número de populações, no sentido de salvaguardar maior diversidade genética existente da espécie. Além disso, estudos com marcadores moleculares podem no futuro gerar marcadores que possibilitem rastrear a origem da matéria prima para

fitomedicamentos derivados desta espécie (Percifield et al., 2007).

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CONCLUSÕES

Os acessos que se apresentaram mais divergentes

foram GUR e ARR. Os acessos ANA e NAT mostraram a maior similaridade genética .

Na formação dos grupos, não houve relação entre

a similaridade genética e as distâncias geográficas . O uso de marcadores RAPD foi eficienten a

caracterização da estrutura genética entre os acessos de mentrasto, onde essa caracterização molecular pode fornecer informações para evitar

as redundâncias ou misturas de genótipos em estudos e programas de conservação de germoplasma dessa espécie .

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro da REALGENE/CNPq e da UFT.

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Recebido: 03/05/201 3 Received: 05/03/201 3

Aprovado: 02/1 0/2013 Approved: 10 /02/2013

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