Flores, R. et al. 192
Vol. 4, N.3: pp. 192-199, August, 2013 ISSN: 2179-4804
Journal of Biotechnology and Biodiversity
Sucrose and sorbitol on the in vitro conservation of Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hicken (Amaranthaceae).
Rejane Flores1,*, Suzi Cerezer Uliana2, Nathalia Pimentel2, Tanea Maria Bisognin Garlet 2
ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the effect of sucrose and sorbitol during the in vitro conservation of Pfaffia
tuberosa (Spreng.) Hicken. Therefore, nodal segments derived from in vitro cultures were inoculated in a culture
medium supplemented with sucrose concentrations (0, 20 and 30 g L-1) combined with sorbitol concentrations (10, 20 and 40 g L-1) plus the control treatment (30 g L-1 sucrose). The results showed the possibility to maintain of the P. tuberosa plants for a 120 days period under slow growth in a medium supplemented with 10 g L-1 of sorbitol,
without sucrose.
Key-words: In vitro conservation, micropropagation, germoplasm, Pfaffia .
Sacarose e sorbitol na conservação in vitro de Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hicken (Amaranthaceae).
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da sacarose e do sorbitol na conservação in vitro de Pfaffia
tuberosa (Spreng.) Hicken. Para isso, segmentos nodais provenientes de plantas cultivadas in vitro foram inoculados em meio de cultura suplementado com concentrações (0, 20 e 30 g L-1) de sacarose em combinação com concentrações (10, 20 e 40 g L-1) de sorbitol, mais um tratamento controle (30 g L-1 de sacarose). Os resultados
mostraram a viabilidade de manter plantas de P. tuberosa, por um período de 120 dias, sob condições de crescimento reduzido, em meio acrescido de 10 g L-1 de sorbitol, na ausência de sacarose.
Palavras-chave: conservação in vitro, micropropagação, germoplasma, Pfaffia .
Autora para correspondência.
1*Professora do Instituto Federal Farroupilha, São Vicente do Sul, RS
2Departamento de Biologia, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS
Biotec. Biodivers. v. 4, N.3: pp. 192-199, Aug. 2013
https://doi.org/10.20873/jbb.uft.cemaf.v4n3.flores
Flores, R. et al. 193
INTRODUÇÃO
Atualmente, as plantas medicinais nativas estão
sujeitas a uma intensa erosão genética devido principalmente à destruição de habitats, causado pela expansão das atividades agropecuárias, pela
exploração predatória e outros fatores relacionados à ocupação humana. Diante disso, a conservação de
germoplasma de espécies vegetais vem sendo muito utilizada, evitando-se assim o risco de extinção e permitindo que vários genótipos estejam disponíveis
para utilização futura. Dentre os diferentes métodos de preservação de germoplasma, destaca-se a conservação in vitro, onde coleções de plantas são
mantidas em condições laboratoriais, por longos períodos (Nass, 2001; Sarasan, et al., 2006) ,
forma mais lenta (Dumet et al., 1993; Shibli et al., 2006) e, assim, possibilitando sua conservação. Recentemente, protocolos para a
conservação in vitro de germoplasma de Pfaffia
glomerata (Spreng.) Pedersen, utilizando sacarose e sorbitol, foram desenvolvidos por
Alves et al. (2006; 2010). Contudo, nos dias atuais, há poucas pesquisas referentes à
conservação in vitro do gênero.
Pfaffia tuberosa, conhecida como corango-de - batata, é uma espécie herbácea, com folhas
opostas, caules retos pilosos ou quase glabros e inflorescência cimosa paleácea formada por
flores pequenas e hermafroditas (Marchioretto et al., 2010). É uma planta perene, xerófita e
constituindo-se um dos métodos mais importantes heliófita, encontrando-se distribuída
para a conservação de recursos genéticos vegetais (Sarasan et al., 2006). Dentre as vantagens da conservação in vitro, destacam-se a manutenção dos genótipos em condições assépticas, a redução nos
custos e mão-de-obra, a otimização do espaço físico,
além da facilidade de intercâmbio do material vegetal (Engelmann, 2011) .
Em geral, dois métodos vêm sendo adotados n a conservação de plantas in vitro: a criopreservação e o crescimento lento. Na criopreservação, as plantas
são conservadas em temperaturas ultra-baixas e,
assim, há uma supressão completa do crescimento . Já no método crescimento lento, as plantas são
submetidas a condições que reduzem ou suprimem o metabolismo das plantas in vitro, aumentando- se
assim o intervalo entre os subcultivos, o que leva a
uma redução da mão de obra, do espaço e custos para a manutenção das plantas (Scherwinski- Pereira,
2010). Dependendo do genótipo, a redução do crescimento pode ser feita através de modificações
nas condições físicas de cultivo (redução na luminosidade /ou na temperatura da sala de
crescimento) em conjunto ou não com modificações
no meio de cultura (redução de sais, adição de osmorreguladores, adição de inibidores de crescimento e/ou inibidores de etileno) ( George,
1996; Conceição et al., 1998; Sarasan et al., 2006 ). Os carboidratos adicionados ao meio nutritivo
afetam significativamente o crescimento e as respostas fisiológicas das plantas in vitro, atuando tanto como fonte de energia e de carbono como regulador osmótico do meio de cultura. Dependendo da concentração, osmorreguladores, como manitol, sorbitol, sacarose, dentre outros, ao serem
adicionados ao meio de cultura, atuam removendo o excesso da água intracelular, por gradiente osmótico, fazendo com que o crescimento da cultura ocorra de
uniformemente em vários estados do Brasil , especialmente no bioma pampa. Adaptada às condições climáticas do sul do Brasil, esta
espécie tolera bem o frio e a geada, porém se mantém bem desenvolvida e em florescimento
durante a primavera e verão. Assim como outras espécies do gênero, P. tuberosa contem vários metabólitos secundários de interesse medicinal , como saponinas triterpênicas e o fitoecdisteróide -ecdisona (Nishimoto et al., 1986), o qual se
encontra em maior quantidade nas partes aéreas da planta (Flores et al., 2010) .
Vários estudos já foram desenvolvidos tendo em vista a propagação clonal de P. tuberosa ( Flores et al, 2006; Flores et al.; 2007; Flores et al., 2010), entretanto dados sobre a conservação de
germoplasma da espécie são inexistentes até o momento. Desta forma, com este trabalho objetivou-se estudar o efeito de concentrações de sacarose e sorbitol na conservação in vitro dessa espécie.
MATERIAIS E MÉTODO S
Utilizaram-se plantas jovens de P. tuberosa
(Spreng.) Hicken (Amaranthaceae), coletadas no município de São Pedro do Sul, RS. Exsicatas
encontram-se depositadas no Herbário do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Santa Maria, sob o número de SMDB
9840 .
Brotos jovens oriundos de plantas adultas foram
desinfestados como segue: 1) lavagem em água com detergente comercial (2 gotas/100mL)
durante 2 minutos; 2) imersão em solução de álcool 70% por 10 segundos; 3) imersão dos segmentos caulinares em solução de hipoclorito
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de sódio a 1% acrescido de detergente (2 gotas/100mL) por 10 minutos; 4) cinco lavagens consecutivas em água. Todas as etapas foram feitas
sob agitação constante. Em seguida, segmentos
nodais (com cerca de 1 cm) foram cultivados em meio MS (Murashige e Skoog, 1962), acrescido de
sacarose (30 g L-1), mio-inositol (100 mg L-1) e ágar (6 g L-1), segundo metodologia de micropropagação
descrita por Flores et al. (2006 ).
Tendo em vista a conservação das plantas in vitro , segmentos nodais (1,0 cm) de plantas, pertencentes
ao quarto subcultivo em meio de multiplicação , foram cultivados em meio MS com sais reduzidos a
metade (MS/2) e suplementado com concentrações
de sacarose (0, 20 e 30 g L-1) e sorbitol (10, 20 e 40 g L-1), além de um tratamento controle (30 g L-1 de
sacarose), totalizando dez tratamentos. A escolha do meio de cultivo, bem como dos carboidratos utilizados neste estudo baseou-se nos melhores
resultados obtidos na conservação in vitro de P faffia glomerata (Alves et al., 2010) .
Os explantes foram inoculados verticalmente em tubos de ensaio, contendo 10 mL de meio nutritivo. O pH foi ajustado para 5,8 e o meio foi autoclavado (1 atm, 121 ºC) durante 20 minutos. A inoculação e a repicagem das culturas foram realizadas em câmara de fluxo laminar, em condições assépticas,
colocando-se um explante por tubo de ensaio (25 mm de diâmetro, 150 mm de altura e 147,26 cm3 de
volume interno). As plantas foram cultivadas em sala de crescimento com temperatura de 25±2ºC, 16 horas de fotoperíodo e 35 µM m-2 s-1 de luminosidade.
As avaliações foram realizadas aos 30, 60, 90 e 120 dias, observando-se a porcentagem de regeneração e
crescimento dos brotos, o número de segmentos nodais e a coloração das folhas. A variável crescimento dos brotos (relação entre o tamanho
final e inicial) foi realizada conforme metodologia de Fortes e Pereira (2001). Para a avaliação da coloração das folhas, utilizou-se a seguinte escala de
notas: 1 - folha com coloração amarela/marrom (sintomas severos); 2 - folhas com coloração
vermelho-violácea (sintomas intermediários); 3 - folhas com coloração verde e/ou vermelho- violácea
(sintomas leves) e 4 - folhas com coloração verde
(coloração normal, sem sintomas), conforme metodologia adaptada de Faria et al. (2006).
Após 120 dias de cultivo, segmentos nodais d as plantas regeneradas no tratamento que apresentou os
melhores resultados em relação ao crescimento
lento, além do tratamento controle, foram subcultivadas em meio MS contendo 30 g L-1 de
sacarose, conforme metodologia de propagação para essa espécie (Flores et al., 2006). Após 30 dias, as plantas foram avaliadas em relação aos
parâmetros percentagem de regeneração e
crescimento, número de segmentos nodais, coloração das folhas e percentagem de
enraizamento.
Plantas completas foram aclimatizadas conforme metodologia de Flores et al. (2006) e a percentagem de sobrevivência foi avaliada após
30 dias do transplantio para o substrato .
Utilizaram-se seis repetições, sendo cada repetição formada por cinco plantas. O
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso. A percentagem de
crescimento das plantas ao longo dos
subcultivos foi avaliada através de regressão polinomial. Para os demais dados considerou- se somente a última avaliação, os quais foram
submetidos à análise de variância e analisados pelo teste de Tukey, ao nível de 1% de
probabilidade pelo teste F. Os dados expressos em percentagem foram transformados segundo arco seno raiz quadrada de (X/100), onde X significa o valor percentual obtido. Para a variável número de segmentos nodais, os dados foram transformados segundo a raiz quadrada de
(X+1), onde X é o valor obtido por contagem. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Da mesma forma que observado em P. glomerata por Alves et al. (2010), neste estudo, verificou-se que as concentrações de sacarose e sorbitol influenciaram significativamente o
crescimento das plantas in vitro (Figura 1 ,
Tabela 1). As plantas cultivadas em meio contendo somente sorbitol como fonte de carboidrato apresentaram as menores taxas de
crescimento ao longo do tempo (Figura 1a) . Apesar de a sacarose ter favorecido o crescimento das plantas na presença de 10 e 20 g
L-1 de sorbitol, essas apresentaram crescimento inferior ao controle (Figura 1b, 1c). O tratamento contendo 40 g L-1 de sorbitol foi o
que mais afetou negativamente o crescimento das plantas, sendo observado um leve incremento neste parâmetro com a adição de 30
g L-1 de sacarose ao meio nutritivo (Figura 1c).
De fato, outros estudos também relatam que a adição de sacarose tem um efeito benéfico no
crescimento e desenvolvimento de plantas in vitro (Fortes e Pereira, 2001; Faria et al., 2006) .
Além de favorecer o crescimento das plantas, a
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adição da sacarose no meio nutritivo mostrou- se
benéfica para a regeneração de brotações naqueles tratamentos contendo 20 e 40 g L-1 de sorbitol
potencial osmótico do meio. Então, conforme salienta Marino et al. (2010), a sacarose tem duplo papel na regulação da organogênese,
(Tabela 1). Em adição, independente da atuando como fonte de energia/carbono e como
concentração de sacarose, registrou-se uma redução no crescimento das plantas com o aumento da
concentração de sorbitol no meio nutritivo (Figura 1, Tabela 1). Da mesma forma, observou-se que o
aumento da concentração de sorbitol reduziu a taxa
de multiplicação in vitro, exceto no tratamento contendo 20 g L-1 de sorbitol e 30 g L-1 de sacarose,
cuja taxa de multiplicação não diferiu significativamente em relação ao controle (Tabela
1).
As células e tecidos in vitro normalmente requerem um carboidrato para suprir suas demandas energéticas, sendo a sacarose, a fonte de carbono
mais amplamente utilizada in vitro, inclusive com o gênero Pfaffia (Maldaner el al., 2006). Na maioria
das espécies, a sacarose influencia fortemente o potencial morfogênico (Al-Khateeb, 2008),
favorecendo o desenvolvimento das plantas até uma determinada concentração, onde o crescimento e as respostas fisiológicas alteram-se em função do
osmorregulador.
Já o sorbitol (um açúcar álcool) é um dos
carboidratos mais efetivos na indução do crescimento in vitro de espécies pertencentes à
família Rosaceae, tendo nesta família de plantas
um papel similar ao da sacarose (Li et al., 2012). Contudo, diferentemente das rosáceas, não são
todas as espécies de plantas que possuem mecanismos para metabolizar o sorbitol. Assim,
a redução no crescimento e nas respostas morfológicas das plantas de P. tuberosa em
meio suplementado somente com sorbitol pode
ser explicado pela possibilidade desta espécie não possuir o mecanismos bioquímicos necessários para metabolizar o sorbitol. N este
caso, em P. tuberosa, o sorbitol atuaria exclusivamente como regulador osmótico,
reduzindo o potencial hídrico do meio conforme o aumento da sua concentração, minimizando assim, o crescimento das plantas.
a b
1200 1000 800 600
400
200
0
0
30
60
90 120 150
1200 1000 800 600
400
200
0
0
30
60
90 120 150
Avaliações (dias )
10 g L-1 de sorbitol (y=-138,8+4,9953x R2 =0,9899) 20 g L-1 de sorbitol (y=-52,4+1,908x R2 =0,9918)
40 g L-1 de sorbitol (y=4,6+0,2727x R2 =0,9217) controle (y=-196,4+9,912x R2 =0,9852)
Avaliações (dias )
10 g L-1 de sorbitol (y=-76,2+7,1873x R2 =0,9989) 20 g L-1 de sorbitol (y=-93,2+5,32x R2 =0,9873)
40 g L-1 de sorbitol (y=25,7+0,1453x R2 =0,8432) controle (y=-169,4+9,912x .R2 =0,9852)
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1200 1000 800 600
400
10 g L-1 de sorbitol (y=-138,8+4,9953x R2 =0,9852) 20 g L-1 de sorbitol (y=-137,4+8,0213x R2 =0,9936) 40 g L-1 de sorbitol (y=-35,2+4,2587x R2 =0,9655) controle (y=-196,4+9,912x R2 =0,9852)
200
0
0
30
60 90 120 150
Avaliações (dias )
FIGURA 1. Efeito de concentrações de sorbitol e sacarose na percentagem de crescimento de brotações de Pfaffia tuberosa, ao longo de 120 dias de cultivo in vitro. a) Percentagem de crescimento dos brotos em função das concentrações de sorbitol em meio isento de sacarose; b) Percentagem de crescimento dos brotos em função das
concentrações de sorbitol na presença de 20 g L-1 de sacarose; c) Percentagem de crescimento em função das concentrações de sorbitol na presença de 30 g L-1 de sacarose. Controle: meio nutritivo contendo somente 30 g L- 1
de sacarose.
Neste estudo, apesar de o sorbitol reduzir o crescimento das plantas e assim, favorecer sua
conservação in vitro, o aumento da concentração desse carboidrato induziu sintomas de toxidez. E stes
sintomas caracterizaram-se por modificações na
coloração das folhas, as quais se alteraram de verde s para uma coloração vermelho-violáceo, seguido de tons amarelos e marrons, além da presença de
necrose e abscisão foliar. Conforme mostra a Tabela 1, maiores alterações na coloração das folhas foram
observadas com o aumento da concentração de sorbitol, independente das concentrações de
sacarose. Por outro lado, em P. glomerata , melhores resultados em relação à redução do
crescimento das plantas foram registrados com 4% de sorbitol (correspondente a maior
concentração utilizada neste estudo) jun tamente
com 2% de sacarose, não sendo relatada a presença de sintomas de toxidez nas plantas (Alves et al. 2010). Da mesma forma, em
Passiflora giberti N. E. Brown, o aumento na concentração de sorbitol não afetou a qualidade
das plantas in vitro (Faria et al., 2006).
TABELA 1 – Percentagem de regeneração e crescimento das brotações, taxa de multiplicação e coloração das folhas de Pfaffia tuberosa em função de concentrações de sacarose e sorbitol, após 120 dias de cultivo in vitro .
Sacarose (g L-1 )
Sor bitol (g L-1 )
Regeneração (%)*
Crescimento (%)*
Número de segmentos nodais *
Coloração das folhas**
0
10
20
40
100,0 a
84,1 ab 77,0 ab
462,4 cd
182,0 de 34,8 e
7,9 ab
3,7 b 0,3 c
3,8 a
3,1 a 1,4 b
20
10
20
40
100,0 a
100,0 a 100,0 a
785,6 ab
567,4 bc 41,0 e
11,6 a
13,7 a 0 c
3,4 a
3,0 a 1,4 b
30
10
20
40
100,0 a
100,0 a 96,6 ab
814,4 ab
466,6 cd 143,6 e
9,0 ab
10,1 a 0 c
3,0 a
2,8 a 1,4 b
Controle 100,0 a 949.6 a 9,5 a 3,3 a
*Valores médios seguidos de mesma letra não diferem entre si, pelo Teste de Tukey, em nível de 5% de
probabilidade de erro. **Onde: 1-folha com coloração amarela/marrom; 2-folha com cor vermelho- violácea; 3-folha verdes e/ou vermelho-violácea e 4-folhas com coloração verde.
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De forma geral, observou-se que as plantas regeneradas nos tratamentos com 40 g L-1 de sorbitol
apresentaram as menores taxas de crescimento, o que é desejável para a conservação in vitro, contudo
essa concentração de sorbitol levou a uma red ução significativa na taxa de multiplicação e na
viabilidade (avaliada através da variável coloração das folhas) das plantas (Tabela 1). Outros estudos
com o objetivo de conservar plantas em meio
contendo sorbitol também registraram sintomas de toxidez (Lemos et al., 2002). Efeitos negativos de
altas concentrações de carboidratos no crescimento in vitro também foram registrados por Al- Khateeb
(2008).
Deve-se levar em consideração que durante a conservação in vitro, a planta deve se manter viável e com capacidade de retomar o crescimento normal
após ser cultivada em meio que promova seu crescimento e multiplicação. Diante disso, neste
estudo com P. tuberosa, os melhores resultados foram obtidos em meio contendo 10 g L-1 de
sorbitol, onde os explantes apresentaram 100% de regeneração, as plantas apresentaram crescimento inferior a 50% em relação às plantas controle e, além disso, a maioria dos brotos não apresentaram sintomas de toxidez após 120 dias de cultivo (Tabela 1, Figura 2). Da mesma forma, melhores re sultados
em relação à conservação in vitro Passiflora giberti N. E. Brown foram registradas em meio suplementado com sorbitol e isento de sacarose (Faria et al., 2006), onde as plantas apresentaram um
menor crescimento in vitro .
Após o subcultivo das plantas conservadas, durante 120 dias em meio com 10 g L-1 de
sorbitol, para um novo meio nutritivo utilizado
para a micropropagação desta espécie (Flores et al., 2006), observou-se que os parâmetros
percentagem de regeneração, coloração das folhas e percentagem de enraizamento não
diferiram estatisticamente em relação ao
controle (Tabela 2). Entretanto, as plantas cultivadas com 10 g L-1 de sorbitol apresentaram
um leve declínio no crescimento e no número de segmentos nodais quando comparadas com o
tratamento controle (meio de propagação suplementado 30 g L-1 de sacarose) (Tabela 2).
Estes resultados indicam que as plantas
cultivadas em presença do sorbitol sofreram um maior estresse fisiológico em relação àquelas regeneradas em meio com sacarose, o que se
refletiu em um menor crescimento e formação de segmentos nodais após a transferência das
plantas para um meio de propagação. No entanto, estes parâmetros não afetaram a viabilidade das plantas, as quais foram aclimatizadas com sucesso, apresentando 90% de sobre vivência.
a b
FIGURA 2. Aspecto de plantas de Pfaffia tuberosa cultivadas em meio MS/2 acrescido de 30 g L-1 de sacarose (controle) (a) ou suplementado com 10 g L-1 de sorbitol (b), após 120 dias de cultivo in vitro .
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TABELA 2. Percentagem de regeneração e crescimento, taxa de multiplicação, coloração das folhas e enraizamento de plantas regeneradas em meio contendo 10 gL-1 de sorbitol e 30 gL-1 de sacarose (controle), após subcultivo em
meio MS por 30 dias .
Tratamentos
Regeneração (%) *
Crescimento (%) *
No segmentos nodais *
Coloração das folhas* *
Enraizamento (%) *
Sorbitol (10 g L-1) 100 a 130 b 3,5 b 4,0 a 90,0 a
Controle 99 a 150 a 3,7 a 4,0 a 92,5 a
*Valores médios seguidos de mesma letra não diferem entre si, pelo Teste de Tukey, em nível de 5% de probabilidade de erro. **Onde: 1-folha com coloração amarela/marrom; 2-folha com cor vermelho-violácea; 3 - folha verdes e/ou vermelho-violácea e 4-folhas com coloração verde.
Após transferência das plantas para o solo, estas se mostraram bem adaptadas às novas condições
ambientais, iniciando o desenvolvimento de novas brotações. Não foram observadas alterações morfológicas nas plantas. A metodologia descrita é
pioneira para a espécie e poderá ser utilizada para a
conservação de germoplasma in vitro de P. tuberosa , além de servir como subsídios para pesquisas com
outras espécies pertencentes à família Amaranthaceae.
CONCLUSÃO
Pfaffia tuberosa pode ser conservada in vitro, sob condições de crescimento mínimo, durante 120 dias, em meio MS isento de sacarose e acrescido de 10 g
L-1 de sorbitol. As plantas voltam a se desenvolver
quando se estabelece as condições normais de cultivo in vitro. Na etapa de aclimatização, as mudas
conservadas apresentam um elevado índice de sobrevivência .
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Recebido: 25 /05/2013 Received: 05/25/20 13
Aprovado: 28 /07/2013 Approved: 07/28 /2013
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